一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用技术

本发明专利技术属于农业废弃物处理与生物质产品生产领域，具体涉及一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用。本发明专利技术以农业秸秆纤维水解液为基质，用于培养具备异养能力的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa sp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorella vulgaris sp.)THUZTY1325，菌种保藏号分别为CGMCC NO.12521和CGMCC NO.12522。该方法培养微藻无需光照、所得藻液浓度高、藻细胞生长速度快，可为微藻生物质产品的生产提供廉价的生物质原料，降低生产成本；通过调节培养基的营养条件，可以方便地调控微藻生物质的组成，产出的微藻生物质的总蛋白含量为20％～60％，脂肪酸含量为10％～35％，从而满足不同用途的使用要求；且本发明专利技术可实现对秸秆资源的有效回收利用。

Method for culturing microalgae by using straw fiber hydrolysate and application thereof

The invention belongs to the field of agricultural waste treatment and the production of biomass products, in particular to a method for culturing microalgae using straw fiber hydrolysate and its application. The present invention in agricultural straw hydrolysate as substrate for training with the ability of Heterotrophic Chlorella pyrenoidosa (Chlorella pyrenoidosa sp. THUZTY1304) and Chlorella vulgaris (Chlorella vulgaris sp. THUZTY1325,) geneticstock number were CGMCC NO.12521 and CGMCC NO.12522. The method of culturing microalgae without illumination, the concentration of algae and algae cell growth and high speed, can provide cheap raw materials for microalgal biomass production, reduce production costs; by adjusting the cultivation of nutritional conditions of medium, which can easily control the algal biomass, the total protein content of the microalgae biomass for output from 20% to 60%, the fatty acid content is 10% ~ 35%, so as to meet the requirements of different uses; and the invention can realize the effective recovery of straw resources utilization.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业废弃物处理与生物质产品生产领域，具体涉及一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用。
技术介绍
农业秸秆是一类产量巨大、处理困难的固体废弃物，农业秸秆的回收利用能够减少秸秆对环境的污染、提高农业生产的效益。纤维包括纤维素和半纤维素，是秸秆的主要成分，占秸秆总重的60％～80％。纤维经水解后制得的高浓度糖溶液，可用于微生物的异养培养。微藻生物质富含蛋白、多不饱和脂肪酸、色素等物质，在水产、畜禽养殖和高价值生物产品生产等方面有广泛的应用。现有的微藻培养技术主要是在光照条件下，在跑道式浅塘中，利用人工培养基自养培养微藻。受限于光合作用效率和光的传递损失，光自养条件下，藻液的生物质浓度低、藻细胞生长速度慢，导致微藻生物质生产成本过高，制约微藻生物质产品的大规模应用。开发一种利用秸秆水解液的微藻培养技术，对于实现秸秆的资源化利用和高价值微藻生物质产品的大规模生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用。具体技术方案如下：一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法，以农业秸秆为原料制备纤维水解液，将具备异养生长能力的藻种接种到以纤维水解液为基质配置的培养基中，黑暗条件下异养培养。具体步骤为：1)采用机械法、碱法或亚硫酸铵法处理农业秸秆，去除木质素，将纤维浸泡在缓冲液中，投加纤维素酶，得到纤维水解液；2)采用离心或压滤的方式分离水解液与剩余残渣，在水解液中添加必需无机营养元素，调节水解液pH至6.5-7.5，高温高压灭菌，条件为温度115℃，时间15min，得到以纤维水解液为基质的培养基；3)在培养基中接种微藻，异养培养，培养过程中可进一步投加浓缩水解液，以补充糖分，初始葡萄糖浓度和补料培养时的残糖浓度控制在5～50g/L，待葡萄糖充分利用后，离心收获藻细胞。步骤2)中所述无机营养元素为Na2CO3、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、柠檬酸、K2HPO4·3H2O、NaNO3、EDTA、柠檬酸铁铵，其中糖与总氮的比值为(5:1)～(250:1)，氮磷比为(5:1)～(40:1)，其他营养元素物质含量同BG11培养基(见表1)。步骤3)中所述微藻为具备异养生长能力的单细胞光合微生物，如小球藻、螺旋藻、雨生红球藻、栅藻。步骤3)中所述微藻为蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorellavulgarissp.)ZTY1325，菌种保藏号分别为CGMCCNO.12521和CGMCCNO.12522。所述的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304的18SrDNA序列如SEQIDNo.1所示；所述的普通小球藻(Chlorellavulgarissp.)ZTY1325的18SrDNA序列如SEQIDNo.2所示。所述的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304为单细胞微生物，细胞呈球形，细胞壁平滑，直径3～8μm；所述的普通小球藻(Chlorellavulgarissp.)ZTY1325为单细胞微生物，细胞呈球形，细胞壁平滑，直径8～15μm。步骤3)中所述异养培养的条件为：温度25℃，振荡速率150rpm/min，时间3～10天。步骤3)中所收获微藻的生物质组成随培养基的糖与总氮投加量的比值而变化，其中蛋白含量为20％～60％，脂肪酸含量为10％～35％，培养基的糖氮比越低，微藻生物质的蛋白含量越高，脂肪酸含量越低。微藻在饲料添加剂、色素、化工产品、生物柴油生物质产品生产中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术以农业秸秆纤维水解液为基质，用于培养具备异养能力的经济型微藻。该方法培养微藻无需光照、所得藻液浓度高、藻细胞生长速度快，可为微藻生物质产品的生产提供廉价的生物质原料，降低生产成本；通过调节培养基的营养条件，可以方便地调控微藻生物质的组成，产出的微藻生物质的总蛋白含量为20％～60％，脂肪酸含量为10％～35％，可满足不同用途的使用要求；并且本专利技术可实现对秸秆资源的有效回收利用。生物材料保藏说明分类命名：蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)菌株编号：THUZTY1304保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年06月022日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12521分类命名：普通小球藻(Chlorellavulgaris)菌株编号：THUZTY1325保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年06月022日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12522附图说明图1为蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorellavulgarissp.)THUZTY1325在秸秆纤维水解液和合成培养基中异养生长的生长曲线图。图2为蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorellavulgarissp.)THUZTY1325在秸秆纤维水解液和合成培养基中异养生长的糖浓度变化图。图3为在不同初始总氮条件下，利用秸秆纤维水解液培养蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304时，藻细胞对培养基中总氮的利用情况。图4为利用秸秆纤维水解液培养蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304时，藻生物质的蛋白含量随氮投加量的变化图。具体实施方式本专利技术提出了一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法及其应用，下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：蛋白核小球藻THUZTY1304和普通小球藻ZTY1325的分离与鉴定两株藻种分离自北京市某污水厂的生活污水。取少量污水，以BG11培养基(见表1)稀释后，置于光照条件下扩大培养20～30天；在BG11+2％琼脂的固体平板上划线，继续培养30天左右；挑取平板上的单一藻落，再溶于BG11中扩大培养。重复以上分离步骤2～3次，直至分离出洁净而不受污染的藻落。以提取的微藻DNA为模版，PCR扩增18SrDNA基因，采用以下2对引物进行扩增：①上游引物EK82f(5’-GAAACTGCGAATGGCTC-3’)，和下游引物Proto5r(5’-GACGGGCGGTGTGTAC-3’)，②上游引物16S1N(5’-TCCTGCCAGTAGTCATATGC-3’)，和下游引物16S2N(5’-TGATCCTCTCGCAGGTTCAC-3’)。扩增序列在Genbank中进行同源比对，两个藻落鉴定为蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosasp.)THUZTY1304和普通小球藻(Chlorellavulgarissp.)THUZTY1325。其中蛋白核小球藻THUZTY1304的18SrDNA序列如SEQIDNo.1所示；普通小球藻ZTY1325的18SrDNA序列如SEQIDNo.2所示。蛋白核小球藻TH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法，其特征在于，将具备异养生长能力的藻种接种到以纤维水解液为基质配置的培养基中，黑暗条件下异养培养，具体步骤为：1)采用机械碱法或亚硫酸铵法处理农业秸秆，去除木质素，将纤维浸泡在缓冲液中，投加纤维素酶，得到纤维水解液；2)采用离心或压滤的方式分离水解液与剩余残渣，在水解液中添加必需无机营养元素，调节水解液pH至6.5‑7.5，温度115℃、时间15min条件下高温高压灭菌，得到以纤维水解液为基质的培养基；3)在培养基中接种微藻，异养培养，培养过程中可进一步投加浓缩水解液，以补充糖分，初始葡萄糖浓度和补料培养时的残糖浓度控制在5～50g/L，待葡萄糖充分利用后，离心收获藻细胞。

【技术特征摘要】
1.一种利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法，其特征在于，将具备异养生长能力的藻种接种到以纤维水解液为基质配置的培养基中，黑暗条件下异养培养，具体步骤为：1)采用机械碱法或亚硫酸铵法处理农业秸秆，去除木质素，将纤维浸泡在缓冲液中，投加纤维素酶，得到纤维水解液；2)采用离心或压滤的方式分离水解液与剩余残渣，在水解液中添加必需无机营养元素，调节水解液pH至6.5-7.5，温度115℃、时间15min条件下高温高压灭菌，得到以纤维水解液为基质的培养基；3)在培养基中接种微藻，异养培养，培养过程中可进一步投加浓缩水解液，以补充糖分，初始葡萄糖浓度和补料培养时的残糖浓度控制在5～50g/L，待葡萄糖充分利用后，离心收获藻细胞。2.根据权利要求1所述的培养微藻的方法，其特征在于，步骤2)中所述无机营养元素为Na2CO3、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、柠檬酸、K2HPO4·3H2O、NaNO3、EDTA、柠檬酸铁铵，其中糖与总氮的比值为(5:1)～(250:1)，氮磷比为(5:1)～(10:1)。3.根据权利要求1所述的培养微藻的方法，其特征在于，步骤3)中所述微藻为具备异养生长能力的单细胞光合微生物，如小球藻、螺旋藻、雨生红球藻、栅藻。4.根据权利要求1所述的培养微藻的方法，其特征在于，步骤3)中所述微藻为蛋白核小球藻(Chlorellapyren...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡洪营，张天元，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11