The present invention discloses an improved cell-free synthesis system, which includes the improvement of the reagent. In addition, the application of cell free synthesis system, the invention also discloses the improvement in skeletal muscle receptor tyrosine kinase in the synthesis include: (1) synthesis and cloning of skeletal muscle receptor tyrosine kinase gene; (2) to construct the recombinant plasmid of Escherichia coli S30; (3) extract preparation; (4) semicontinuous cell-free protein synthesis reaction; (5) precipitation treatment. The invention adopts the method of improved cell-free synthesis, which can be used for synthesizing skeletal muscle receptor tyrosine kinase in vitro and improving the expression efficiency.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白制备
,具体涉及一种改进的无细胞合成系统及其应用。
技术介绍
天然内膜蛋白质存在于生物膜的脂类环境中,但是目前研究内膜蛋白质的技术是首先把它们分散在水溶液的环境中,参照水溶性蛋白质的方法进行操作。为了有效的研究内膜蛋白质,将其溶解于水环境是必要的前提。目前通常是通过加入去污剂使得内膜蛋白质和脂类在水中形成可溶性的复合物来完成的。内膜蛋白质的溶解是一个粗暴的处理过程,在此过程中经常会发生蛋白质变性和/或聚集。为了避免蛋白质的损失和失活,该过程优化时需要非常小心。因此溶解过程是处理膜蛋白质的最关键的步骤。骨骼肌受体酪氨酸激酶(MuSK)是存在于哺乳动物体内的一种抗原蛋白,骨骼肌受体酪氨酸激酶是一种与乙酰胆碱受体相关的跨膜蛋白,在骨骼肌的发展中,骨骼肌受体酪氨酸激酶是建立突触后膜时组建主要突触骨架的首要要求,重症肌无力(myastheniagravis,MG)是一种由自身抗体引起的、累及神经肌肉接头(NMJ)处的自身免疫性疾病,肌肉特异性激酶抗体(MuSKAb)在重症肌无力中的起病和病情发展中起着很重要的作用.目前关于骨骼肌受体酪氨酸激酶抗体在重症肌无力中的作用仍是国际上研究的热点之一,该研究对骨骼肌受体酪氨酸激酶有着一定的需求量.但是该蛋白在普通的表达系统中很难表达,由于较强的疏水性,几乎是不表达的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题而提供。本专利技术通过以下技术方案实现:1.骨骼肌受体酪氨酸激酶基因的合成和克隆从GeneBank中查找分泌型表达人肌肉特异性激酶的cDNA,取其24-495AA的氨基酸序列,在不改变氨基酸序 ...
【技术保护点】
一种改进的无细胞合成系统,其特征在于,所述无细胞合成系统中的供应试剂不含mRNA模板。
【技术特征摘要】
1.一种改进的无细胞合成系统,其特征在于,所述无细胞合成系统中的供应试剂不含mRNA模板。2.一种制备骨骼肌受体酪氨酸激酶的方法,其特征在于,具体步骤如下:(1)骨骼肌受体酪氨酸激酶基因的合成和克隆:从GeneBank中查找分泌型表达人肌肉特异性激酶的cDNA,取其24-495AA的氨基酸序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后合成基因,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,以合成的DNA作为PCR模板,设计上游引物与下游引物,引入双酶切位点到该基因两端,进行PCR扩增;(2)重组质粒的构建:回收PCR扩增得到的1.4kb条带胶并用内切酶双酶切,载体pET28a用同样的内切酶双酶切,回收大的片段;用T4DNA连接酶连接载体和目的片段,以其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中,筛选重组子得到重组质粒pET28a-MuSK;(3)大肠杆菌S30抽提物的制备:选取大肠杆菌BL21(DE3),用细胞悬浮缓冲液悬浮大肠杆菌细胞,用高压均质机破碎,离心,去除沉淀,得到大肠杆菌抽提物,所有步骤均在冰上操作;(4)半连续无细胞蛋白合成反应:将300μL标准反应混合物装于D-TubeTMDialyzerMidi(Thermo,3.5kDa)中,4.5mL供应试剂Feedingbuffer装于50mLCorning离心管中,将D-TubeTMDialyzerMidi放入50mL离心管中,30℃孵育过夜,离心,分离上清和沉淀;(5)沉淀处理:沉淀用PBS重悬,离心,去掉上清,重复...
【专利技术属性】
技术研发人员:华权高,沈鹤霄,马峰,罗绍祥,肖颖,舒芹,徐春雷,王静,邓陈玲,易汪雪,李昆鹏,
申请(专利权)人:武汉金开瑞生物工程有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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