一种G5‑MoS2/Bcl‑2 siRNA复合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种G5‑MoS2/Bcl‑2siRNA复合物的制备方法，包括：将LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5‑LA；将G5‑LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤，得到G5‑MoS2纳米花；将G5‑MoS2纳米花与Bcl‑2 siRNA孵育20～30min，得到G5‑MoS2/Bcl‑2 siRNA复合物。本发明专利技术的方法具有工艺简单，易操作，光热转换效率高，转染条件简单，转染效率高等优点，在光热和基因双重治疗中有良好的应用前景。

A preparation method of G5 MoS2/Bcl 2 siRNA complexes

Including the preparation method, the invention relates to a G5 MoS2/Bcl 2siRNA complexes: LA by EDC - HCl and NHS activation, activation of LA; and then the solution was dripped into the LA G5.NH2 activation in response to 24h, dialysis and freeze drying, G5 LA G5 LA joined; to MoS2 solution, ultrasonic oscillation, mixing 12h, centrifugation, washing, G5 MoS2 nanoflower; G5 MoS2 nanoflower and Bcl 2 siRNA incubated for 20 ~ 30min, G5 MoS2/Bcl 2 siRNA complexes. The method of the invention has the advantages of simple process, easy operation, high light and heat conversion efficiency, simple transfection condition, high transfection efficiency, etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于光热和基因双重治疗中纳米材料的制备领域，特别涉及一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法。
技术介绍
癌症治疗方法的探索，是一个不断发展又不断遇到挑战的过程。传统的治疗方法比如外科手术，化学治疗和放射治疗存在着很多缺点，这些缺点体现在以下几个方面：第一，肿瘤部位不能完全被切除，可能导致肿瘤的再生和转移；第二，长期的化疗可能导致肿瘤的多重耐药性；第三，对正常的细胞也存在损伤，进而引发恶心，脱发和乏力等副作用。因此，开发一种新型的肿瘤治疗体系显得至关重要。这种体系需要对生物体友好，同时具有高效的肿瘤治疗效率和较低的副作用。近些年，光热治疗作为一种新型的，副作用少的，短期的治疗方法，吸引了很多研究者的关注。光热治疗是利用具有较高光热转换效率的材料，在外部光源(一般是近红外光)的照射下杀死癌细胞的一种治疗方法。在这种情况下，光热治疗剂能吸收光能并将光能转化为热能来产生较高的温度，从而导致癌细胞的死亡。随着光热治疗方法的兴起，迄今已经发展了四代材料体系：第一种，具有高光热转换效率的贵金属纳米材料，比如金(Au)、银(Ag)、钯(Pd)等，但其价格昂贵限制其广泛运用；第二种，具有较大光热转换面积的碳类材料，包括石墨烯和碳纳米棒等，但是其亲水性和近红外吸收能力较差；第三种，有机染料，比如吲哚菁绿、普鲁士蓝等，虽然拥有较高的光热转换效率但容易被分解；第四种，金属和非金属化合物，例如硫化铜(CuS)和硫化锌(ZnS)，虽在光热治疗上具有较好的应用前景，但是却也存在着对组织和细胞潜在的慢性毒性。二硫化钼(MoS2)作为一种过渡金属二硫化物无机材料，具有独特的结构特点和近红外吸收能力，其良好的生物相容性和强的光热转换效率使其成为一种安全高效的新型光热剂。然而仅仅通过光热治疗并不能够保证将癌细胞完全的杀死，因此考虑通过协同治疗来实现癌症的治疗。由小干扰RNA(siRNA)介导的基因治疗作为另一种有前景的治疗方法，已成为一种热点研究课题。siRNA通过在细胞内诱导特异性的基因沉默从而杀死癌细胞。然而，siRNA容易被细胞内的酶降解，而且由于其与细胞表面类似的电荷使其不易被细胞内吞。因此，摆在研究者面前的难题依旧是研发一种安全而高效的基因传递载体用于siRNA的传递。在前期的工作中，树状大分子包裹的金纳米颗粒和功能化的树状大分子包裹的金纳米颗粒都被证明是一种安全高效的基因传递载体。因此，将光热治疗和基因治疗结合在一起是一种合理的，并可执行的双重治疗方法。检索国内外相关文献和专利结果表明：以第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼作为载体，实现光热和基因双重治疗的方法，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种G5-MoS2(第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼)/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，该方法具有工艺简单，易操作，光热转换效率高，转染条件简单，转染效率高等优点，在肿瘤的光热和基因双重治疗中有良好的应用前景；制备的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼能实现癌细胞的光热治疗同时负载的Bcl-2siRNA能诱导特异性癌细胞基因沉默。本专利技术制备的G5-MoS2是一种良好的光热剂，较高的光热转换效率能将光能高效的转化为热能，同时它也是一种安全的基因载体，能够负载治疗性的Bcl-2siRNA诱导特异性的基因沉默。本专利技术的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，包括：(1)将硫辛酸LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到第五代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5-LA；(2)将步骤(1)中的G5-LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤(经多次水洗离心去除多余的G5-LA)，得到G5-MoS2纳米花；(3)将步骤(2)中的G5-MoS2纳米花与Bcl-2siRNA孵育20～30min，得到G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物。所述步骤(1)中活化时LA、EDC·HCl与NHS的摩尔比为1：15：15；活化时的溶剂为DMSO；LA、EDC·HCl与NHS的质量分别为3.996，51.81mg，33.18mg。所述步骤(1)中活化的具体过程为：将LA溶解在DMSO中，加入EDC·HCl和NHS溶液，搅拌反应3h，得到活化的LA。所述步骤(1)中G5.NH2与LA的摩尔比为1：10；其中，G5.NH2与LA的质量分别为50mg和3.996mg。所述步骤(1)中G5.NH2的溶液的溶剂为DMSO。所述步骤(1)中透析的条件为：为用去离子水透析3d，每天3次，每次4L去离子水，其中；透析袋截留分子量为14000。所述步骤(2)中G5-LA与MoS2的质量比为5：1；其中，G5-LA与MoS2的质量分别为54.00mg和10.80mg。所述步骤(2)中MoS2的制备方法为：将(NH4)2MoS4溶解在去离子水中，加入(N2H4)·H2O，超声振荡(30min)，得到混合液，将得到的混合液倒进聚四氟乙烯内胆的反应釜中，然后在200℃反应10h，冷却，得到黑色的溶液，离心清洗(用水洗和离心的方式对MoS2进行纯化，反复进行10次后)，得到MoS2(将纯化的MoS2溶解在去离子水中，在4℃保存备用)。所述(NH4)2MoS4和(N2H4)·H2O的质量比为4.5：1；其中，(NH4)2MoS4和(N2H4)·H2O的质量分别为100mg和22.27mg。所述步骤(2)中超声振荡的时间为30min。所述步骤(2)中离心的转速为：10000rpm。所述步骤(3)中Bcl-2siRNA的规格为10OD。所述步骤(3)中G5.NH2与Bcl-2siRNA的N/P比为2.5：1～15：1；所述的N/P比为G5.NH2上的伯氨基与siRNA骨架上磷酸基团摩尔比。所述步骤(3)中孵育的方法为：将G5-MoS2用无菌PBS稀释，然后用DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液稀释Bcl-2siRNA，再将二者混合均匀后于37℃孵育30min，即可。所述步骤(3)中G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物应用于光热和基因双重治疗中制剂的制备。本专利技术中将表面拥有丰富氨基基团的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰与含羧基的LA相连，合成了G5-LA聚合前体，随后通过巯基化学的方法将G5修饰到MoS2的表面，可以提高MoS2的表面电势，降低其水动力学直径，从而提高材料的生物相容性。而MoS2又可以为G5提供较强的光热转换效率，赋予其优秀的光热治疗效果。本专利技术中将合成的G5-MoS2纳米花与Bcl-2siRNA通过静电相互作用结合，能够安全有效的将siRNA传递到癌细胞中，实现对对基因的特异性沉默。本专利技术合成的G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物，因同时具有光热转换性能和基因沉默能力，可以最终实现肿瘤的光热和基因双重治疗。本专利技术采用水热法制备了MoS2，再合成G5-LA聚合前体，通过巯基化学反应制备了第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼(G5-MoS2)，将其与治疗性的Bcl-2siRNA共同孵育。本专利技术通过简单的化学反应制备一种类似纳米花结构的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼。首先，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种G5‑MoS2/Bcl‑2 siRNA复合物的制备方法，包括：(1)将硫辛酸LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到第五代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5‑LA；(2)将步骤(1)中的G5‑LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤，得到G5‑MoS2纳米花；(3)将步骤(2)中的G5‑MoS2纳米花与Bcl‑2 siRNA孵育30min，得到G5‑MoS2/Bcl‑2 siRNA复合物。

【技术特征摘要】
1.一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，包括：(1)将硫辛酸LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到第五代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5-LA；(2)将步骤(1)中的G5-LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤，得到G5-MoS2纳米花；(3)将步骤(2)中的G5-MoS2纳米花与Bcl-2siRNA孵育30min，得到G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物。2.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化时LA、EDC·HCl与NHS的摩尔比为1：15：15；活化时的溶剂为DMSO。3.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中G5.NH2与LA的摩尔比为1：10。4.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中G5-LA与MoS2的质量比为5：1。5.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中MoS2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：史向阳，孔令丹，孙文杰，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31