一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法，包括（1）将木质纤维素原料进行预处理；（2）对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；（4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；（5）将拜氏梭菌XH0906接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇；所述拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9124。本发明专利技术以拜氏梭菌XH0906为发酵菌株，可以同时利用纤维素和半纤维素的水解产物作为发酵底物，具有发酵产率高、丁醇选择性高、耐氧能力强等特点。

Method for preparing butanol by fermentation of lignocellulose

The invention relates to a method for preparing butanol with lignocellulose as raw material fermentation, including (1) the pretreatment of lignocellulosic materials; (2) on the pretreated raw material by enzymatic hydrolysis, cellulose and hemicellulose hydrolysis of mixed sugar; (3) on the hydrolysis of mixed sugar detoxification treatment with calcium hydroxide; (4) with Virus-free sugar as carbon source, adding nutrient preparation fermentation medium; (5) the Clostridium beijerinckii XH0906 were inoculated into the fermentation medium, the fermentation preparation of butanol; Clostridium beijerinckii XH0906, the classification named Clostridium beijerinckii (Clostridium beijerinckii), has been in 05 2014 04 July preserved in general microbial culture collection center Chinese Management Committee, the preservation number is CGMCC No.9124. In the present invention, Clostridium XH0906 is used as the fermentation strain, and the hydrolysis product of cellulose and hemicellulose can be used as the fermentation substrate simultaneously.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法。
技术介绍
丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部门有广泛的用途。而且由于比乙醇多两个亚甲基，丁醇具有更高的疏水性，较低的挥发性，可与汽油以任意比例混合，并具有与汽油相当的热值。作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。随着石油资源的日益枯竭，降低矿物能源的使用比重，加强可再生能源开发已成为人类今后能源利用的重要趋势。而且采用以石油为原料的丙烯羰基合成法生产丁醇由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。由于我国人口众多，用传统的原料（玉米和甘蔗）发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木质纤维素类农业副产物，蕴含大量的纤维素和半纤维素，例如玉米秸秆干物质中纤维素占34-42%，半纤维素占22-28%（岳国君，纤维素乙醇工程概论[M].北京：化学工业出版社，2014）。纤维素的水解产物为葡萄糖，而半纤维素的水解产物主要为木糖，还有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木质纤维素原料水解产生的混合糖中，半纤维素糖（主要为木糖）占30%-40%，因此半纤维素糖的发酵显得至关重要。菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等方面进行。目前工业上用于丁醇生产的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌，具有相似的代谢路径，其发酵产物主要分为3类：1)溶剂（丙酮、乙醇和丁醇）；2)有机酸（乙酸、乳酸和丁酸）；3)气体（包括二氧化碳、氢气等）。他们有的能够利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，有的可以利用木糖、半乳糖和甘露糖，因此可以利用该菌对木质纤维素水解的混合糖进行丁醇丙酮发酵。但是，传统丙酮丁醇发酵普遍存在以下问题：（1）传统的丙酮丁醇发酵菌株需在严格厌氧条件下培养发酵，稍有操作不慎，很容易进入空气，造成菌体不能正常生长，因此在发酵过程中通常需要通入惰性气体如N2来保证无氧环境，能耗较高；（2）丁醇产率低，仅20%左右（质量分数），使得丁醇发酵过程原料成本偏高，制约了丁醇发酵产业的发展；（3）发酵产物除了丁醇外还有40%的丙酮和乙醇等副产物，消耗了有限的碳代谢流，降低了产物中丁醇所占的比例，增加了回收丁醇的难度，提高了能耗。中国专利201110047422.0提供了一种利用丙酮丁醇羧菌厌氧发酵产丁醇的方法，以葡萄糖为底物，初始葡萄糖浓度为60g/L，在通入N2保持发酵罐严格厌氧环境的情况下，对丙酮丁醇羧菌产酸期和产醇期的pH进行调控，总溶剂和丁醇的产量分别为19.20-19.65g/L和11.43%-12.30g/L，丁醇选择性为58.2%-63.1%，溶剂产率为32.0%-32.8%，丁醇产率为19.1%-20.5%。中国专利201210089406.2公开了一株产丁醇的拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）Y-3，该菌是通过对出发菌株ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变获得的突变株，可以木糖渣为原料制备生物丁醇，在以木糖渣酶解液为碳源时，总溶剂产量为16g/L，丁醇产量为8.2g/L，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。中国专利201210163123.8通过基因工程手段抑制丙酮丁醇梭菌中葡萄糖转运蛋白基因（glcG）的表达，增加木糖转运蛋白、木糖异构酶和木糖糖激酶的表达或活力，提高了丙酮丁醇梭菌对木糖的利用率，以丙酮丁醇梭菌ATCC824为出发菌株，获得一株基因工程菌株824GlcG-TBA，使得对木糖的利用率从48.7%增加到93.6%。初始菌株ATCC824的溶剂产量为12.99g/L，其中丁醇7.85g/L，溶剂和丁醇产率分别为22.5%和13.6%。工程菌株824GlcG-TBA的溶剂产量为16.06g/L，其中丁醇9.11g/L，溶剂和丁醇产率分别为28.2%和16.0%。但是，丙酮丁醇发酵菌株存在糖代谢的阻遏效应，即在葡萄糖存在时会优先利用葡萄糖，木糖等其他糖类几乎不消耗。同时丙酮丁醇梭菌本身利用木糖代谢的效率也较低，利用木糖发酵的速率远低于葡萄糖发酵速率。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法。本专利技术以拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）XH0906为发酵菌株，可以同时利用纤维素和半纤维素的水解产物作为发酵底物，具有发酵产率高、丁醇选择性高、耐氧能力强等特点。本专利技术以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法，包括如下内容：（1）将木质纤维素原料进行预处理；（2）对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；（4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；（5）将拜氏梭菌XH0906接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇；所述拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9124；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术所述的拜氏梭菌XH0906为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，可以形成芽孢；接触酶阴性，氧化酶阴性，不同化硝酸盐。该菌株能够高效利用葡萄糖之外其他多种糖类发酵，如可以利用葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、低聚葡萄糖和低聚木糖等中一种或几种作为发酵制备丁醇的碳源；特别是能够高效利用木质纤维素水解糖液中的葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖等作为发酵底物。该菌株在对含有葡萄糖的混合糖液发酵产丁醇的过程中，无葡萄糖优先选择性。本专利技术所述拜氏梭菌XH0906可在非严格厌氧环境下生长和发酵，在pH4.0-9.0，温度20-42℃的条件下均能良好生长，主要产物为丁醇，几乎无丙酮和乙醇副产物产生。本专利技术步骤（1）所述的木质纤维素原料含有纤维素、半纤维素和木质素，可以采用秸秆、木屑、能源植物等，优选采用玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术，包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或上述方法的组合预处理等，优选采用蒸汽爆破预处理。具体过程如下：将切碎的玉米秸秆进入到蒸汽爆破装置的滞留器，在160-210℃下维持5-10分钟，瞬间泄压释放，即得到蒸汽爆破与处理的玉米秸秆。本专利技术步骤（2）预处理后的原料调节pH为4.5-5.0，用自来水配制成固液比为2%-10%（w/v），固体质量与液体体积的百分比，g:mL），加入纤维素酶进行酶解。所述纤维素酶为一切可以把纤维素水解成单糖的酶蛋白，或酶蛋白混合物，其中至少包括3类酶蛋白组分：纤维素外切酶、纤维素内切酶和β-葡萄糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法，其特征在于包括如下内容：    （1）将木质纤维素原料进行预处理；    （2）对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；    （3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；    （4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；    （5）将拜氏梭菌XH0906接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇；所述拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9124。

【技术特征摘要】
1.一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法，其特征在于包括如下内容：（1）将木质纤维素原料进行预处理；（2）对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；（4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；（5）将拜氏梭菌XH0906接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇；所述拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9124。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的拜氏梭菌XH0906为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，可以形成芽孢；接触酶阴性，氧化酶阴性，不同化硝酸盐；能高效利用葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、低聚葡萄糖和低聚木糖中一种或几种作为发酵制备丁醇的碳源；能高效利用木质纤维素水解混合糖液中的葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖作为发酵底物；在对含有葡萄糖的混合糖液发酵产丁醇过程中，无葡萄糖优先选择性。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的拜氏梭菌XH0906在非严格厌氧环境下生长和发酵，在pH4.0-9.0，温度20-42℃的条件下均能良好生长，主要产物为丁醇，几乎无丙酮和乙醇副产物产生。4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆、木屑或能源植物；预处理采用机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理或溶剂预处理，或者上述方法的组合预处理。5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）...

【专利技术属性】
技术研发人员：张全，曹长海，高慧鹏，关浩，王领民，乔凯，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11