唾液酸寡糖-磁纳米粒子及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种唾液酸寡糖‑磁纳米粒子及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的唾液酸寡糖‑磁纳米粒子，其结构通式如式Ⅹ‑1或式Ⅹ‑2所示。本发明专利技术将与流感病毒HA蛋白特异性结合的α2,3唾液酸寡糖和α2,6唾液酸寡糖以共价键连接到磁纳米颗粒上制备获得唾液酸寡糖‑磁纳米粒子，富集分离了H1、H5等亚型的A型流感病毒的HA蛋白和H1、H3、H5及H7等亚型的A型流感病毒毒株，并分析检测了这些流感病毒的受体特异性，实现了对人流感和禽流感病毒的选择性富集分离纯化，能够对浓度较低且成分复杂的样品进行富集分离或受体特异性分析，具有非常好的实用性，对流感病毒的防控具有重要意义。

Sialic acids magnetic nanoparticles and preparation method and application thereof

The invention discloses a sialyloligosaccharides magnetic nanoparticles and preparation method and application thereof. The present invention provides sialyloligosaccharides magnetic nanoparticles, the structural formula x 1 or 2 x type shown. The influenza virus HA protein and specific binding of alpha 2,3 sialic acids and alpha oligosaccharide 2,6 sialic acid attached to magnetic nanoparticles prepared sialyloligosaccharides magnetic nanoparticles with covalent bond, enrichment and separation of type A influenza virus type A influenza virus H1 and H5 subtypes of HA protein and H1, H3, H5 and H7 subtypes, and analyzed the receptor specificity of these influenza virus detection, the purification of selectivity for human flu and bird flu virus enrichment and separation, enrichment and separation can be analyzed or receptor specificity for low concentration and complex samples, has the very good practical that has important significance to prevention and control of influenza virus.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物材料领域，涉及一种唾液酸寡糖-磁纳米粒子及其制备方法与应用。
技术介绍
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人畜共患传染病，它的宿主累及人、猪、鸟、马和海豚等多种动物。灵敏可靠的流感病毒检测手段变得越来越重要。但是到目前为止，最标准化的流感病毒分离鉴定过程涉及到利用细胞、鸡胚或实验动物扩增病毒，进而再进行一系列实验分离鉴定，整个过程至少需要两周时间，耗时耗力。并且实际待测的样品一般是比较复杂的生物样品，流感病毒含量极低。其他被广泛使用的流感病毒的鉴定方法如酶联免疫反应(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)在检测这种病毒含量极低的复杂的生物样品时，会遇到一定得挑战。比如ELISA通常不足够灵敏，而对于PCR，复杂的生物样品在提取核酸时，RNA极易降解以及常常会受到假阳性的干扰等。因此，在检测这种病毒含量极低的复杂的生物样品时，对流感病毒进行一步富集分离就显得极为重要。磁纳米粒子因为具有如下优点，所以在富集分离方面得到了广泛的应用：(1)比表面积比较高，容易结合更多的靶标；(2)粒径均一，单分散；(3)具有超顺磁性，操作方便，省时省力。当前应用研究中用于富集分离流感病毒的磁纳米表面都是包被了能特异识别流感病毒的抗体，使得磁纳米具有了特异结合流感病毒的能力，从而能够对病毒含量极低的复杂的生物样品中的流感病毒进行富集分离纯化。但是，抗体属于生物制品，价格昂贵而且容易变性，所以制备出来的抗体-磁纳米粒子代价高且不易保存和应用，更不能重复多次回收利用。并且，由于抗体一般特异性比较高，每种抗体包被的磁纳米一般只能富集分离特异的流感病毒毒株，在广泛使用性上欠缺。研究证实，流感病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础。流感病毒对唾液酸的识别和结合有偏好型，禽流感病毒倾向于结合Siaα2,3Gal受体，而人流感病毒则主要结合Siaα2,6Gal受体。禽类的肠道主要含Siaα2,3Gal受体，人类的上呼吸道上皮细胞主要有Siaα2,6Gal受体。人流感病毒与人的气管上皮细胞结合紧密，而禽流感病毒与人气管上皮细胞结合很弱。猪既有Siaα2,3Gal受体也有Siaα2,6Gal受体，猪对人流感病毒和禽流感病毒都易感。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种唾液酸寡糖-磁纳米粒子及其制备方法与应用。本专利技术是在磁纳米表面通过共价键连接了各种唾液酸寡糖得到了如下结构的唾液酸寡糖-磁纳米粒子。本专利技术提供的唾液酸寡糖-磁纳米粒子，其结构通式如式Ⅹ-1或式Ⅹ-2所示：所述式Ⅹ-1和式Ⅹ-2中，x为1-3的整数；m为0-11的整数；Ac为乙酰基；R1为羟基或乙酰胺基；R2为氢或L-岩藻糖基R3为氢或硫酸酯基；R4为羟基或乙酰胺基。所述式Ⅹ-1和式Ⅹ-2中，m为2-11的整数或5或11。本专利技术提供的制备所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子的方法，包括如下步骤：将式Ⅹ或式Ⅺ所示化合物通过click反应连接到表面带叠氮基团的磁纳米粒子的表面，得到所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子；所述式X至式XI中，m、Ac、R1至R2的定义与前述定义相同。具体的，所述式X至式XI中，R1为乙酰氨基，R2为氢，R3为氢，R4为羟基；上述方法的click反应步骤中，温度为室温；时间为12-48小时，具体可为24小时；所述式Ⅹ或式Ⅺ所示化合物与所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子的质量比为1：5-20，具体可为1：10；所述click反应是在惰性气氛或氮气气氛中进行；所用催化剂为Cu2SO4·5H2O和抗坏血酸钠；所述Cu2SO4·5H2O和抗坏血酸钠的质量比具体可为1:10；所用溶剂为水和DMF或由等体积比的水和DMF组成的混合液。所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子可按照包括如下步骤的方法制得：将式Ⅻ所示化合物通过酰胺缩合反应连接到表面带羧基的磁纳米粒子表面，得到所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子；N3(CH2CH2O)mCH2CH2NH2式Ⅻ具体的，所述酰胺缩合反应是在缩合剂和溶剂存在的条件下进行的；所述缩合剂为HATU；所述溶剂为DMF；所述缚酸剂为DIPEA；所述酰胺缩合反应的反应温度为室温；反应时间为12-120小时，具体可为72小时；所述式Ⅻ所示化合物、缩合剂和表面带羧基的磁纳米粒子的质量比为(8-2):2:1，具体可为4:2:1。其中，所述表面带羧基的磁纳米粒子具体为Fe3O4@PMAA，更具体可按照如下方法制得：将MCNCs(0.15g)超声溶解在乙醇(20ml)和纯水(5ml)中,加入氨水(0.75ml)和MPS(0.15g)，60℃下机械搅拌24小时。用磁分离法分离Fe3O4@MPS，用纯水洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥后，再利用回流沉淀聚合法在Fe3O4@MPS上包被PMAA(聚丙烯酸)层：在乙腈中，MAA作为单体，MBA作为交联剂，由AIBN引发聚合反应。具体操作如下，Fe3O4@MPS(75mg)超声溶解在ACN(60ml)中，作为纳米核心种子。依次加入MAA(300mg),MBA(75mg)和AIBN(7.5mg),90℃回流1个小时，冷却到常温，用磁分离法分离Fe3O4@PMAA，用乙醇洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥而得。另外，含有上述唾液酸寡糖-磁纳米粒子的溶液，也属于本专利技术的保护范围；所述溶液中，溶剂为PBST，其中，Tween-20与PBS的体积比为0.05：100；所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子在所述溶液中的浓度为1mg/ml。本专利技术还提供了一种富集分离流感病毒及HA蛋白的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为式Ⅹ-1所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子；所述B试剂为式Ⅹ-2所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子。本专利技术还提供了一种富集分离流感病毒及HA蛋白的方法，包括如下步骤：将独立包装的A试剂和/或B试剂与待富集分离的流感病毒或HA蛋白样品孵育，磁性分离去上清，洗涤，浓缩，即得高浓度较纯的流感病毒或HA蛋白。本专利技术还提供了一种检测流感病毒的宿主特异性的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为式Ⅹ-1所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子；所述B试剂为式Ⅹ-2所示唾液酸寡糖-磁纳米粒子。本专利技术还提供了一种检测流感病毒的宿主特异性的方法，包括如下步骤：将独立包装的A试剂和/或B试剂与待测流感病毒毒株或其HA蛋白孵育，磁性分离，洗涤；再将磁纳米和相应的一抗和酶标二抗孵育，磁性分离，洗涤；最后和底物孵育显色，测OD吸收值。当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与A试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染禽源宿主细胞的流感病毒；当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与B试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染人源宿主细胞的流感病毒。本专利技术将与流感病毒HA蛋白特异性结合的α2,3唾液酸寡糖和α2,6唾液酸寡糖以共价键连接到磁纳米颗粒上制备获得唾液酸寡糖-磁纳米粒子，富集分离了H1、H5等亚型的A型流感病毒的HA蛋白和H1、H3、H5及H7等亚型的A型流感病毒毒株，并分析检测了这些流感病毒的受体特异性。此方法具有如下优点，第一，制备简单方便，代价低廉。第二，唾液酸寡糖-磁纳米粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
式Ⅹ‑1或式Ⅹ‑2所示的唾液酸寡糖‑磁纳米粒子：所述式Ⅹ‑1和式Ⅹ‑2中，x为1‑3的整数；m为0‑11的整数；Ac为乙酰基；R1为羟基或乙酰胺基；R2为氢或R3为氢或硫酸酯基；R4为羟基或乙酰胺基。

【技术特征摘要】
1.式Ⅹ-1或式Ⅹ-2所示的唾液酸寡糖-磁纳米粒子：所述式Ⅹ-1和式Ⅹ-2中，x为1-3的整数；m为0-11的整数；Ac为乙酰基；R1为羟基或乙酰胺基；R2为氢或R3为氢或硫酸酯基；R4为羟基或乙酰胺基。2.根据权利要求1所述的唾液酸寡糖-磁纳米粒子，其特征在于：所述式Ⅹ-1和式Ⅹ-2中，m为2-11的整数或5或11；所述磁纳米粒子的平均粒径为50—300nm或100—300nm或200—300nm。3.一种制备权利要求1或2所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子的方法，包括如下步骤：将式Ⅹ或式Ⅺ所示化合物通过click反应连接到表面带叠氮基团的磁纳米粒子的表面，得到所述唾液酸寡糖-磁纳米粒子；所述式X至式XI中，m、Ac、R1至R2的定义与权利要求1中的定义相同。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述click反应步骤中，温度为室温；时间为12-48小时或24小时；所述式Ⅹ或式Ⅺ所示化合物与所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子的质量比为1：5-20或1：10；所述click反应是在惰性气氛或氮气气氛中进行；所用催化剂为Cu2SO4·5H2O和抗坏血酸钠；所用溶剂为水和DMF或由等体积比的水和DMF组成的混合液。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子按照包括如下步骤的方法制得：将式Ⅻ所示化合物通过酰胺缩合反应连接到表面带羧基的磁纳米粒子表面，得到所述表面带叠氮基团的磁纳米粒子；N3(CH2CH2O)mCH2CH2NH2式Ⅻ具体的，所述酰胺缩合反应是在缩合剂和溶剂存在的条件下进行的；所述缩合剂为HATU；所述溶剂为DMF；所述缚酸剂为DIPEA；所述酰胺缩合反应的反应温度为室温；反应时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学兵，张振兴，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11