一种钾离子通道毒素衍生多肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种钾离子通道毒素衍生多肽及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明专利技术钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。将多肽BmKT4的基因片段构建到表达载体pGEX‑4T‑1上，再将重组载体转化到大肠杆菌Rossetta(DE3)进行诱导表达，可获得呈可溶的、非包涵体状态、具有良好活性多肽BmKT4。本发明专利技术的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4能够用于延长秀丽线虫寿命、提高其产卵数、使其产卵时间提前。按照本发明专利技术方法制备BmKT4简单易行，生产成本低廉，纯化简单。

Potassium ion channel toxin derived polypeptide, preparation method and application thereof

The invention discloses a potassium channel toxin derived polypeptide, a preparation method and an application thereof, belonging to the field of biotechnology. Nucleotide sequence and amino acid sequence encoding gene of the invention of potassium channel toxin derived peptides such as SEQ BmKT4 respectively ID NO.1 and 2 shown. The gene fragment of BmKT4 peptides constructed into the expression vector pGEX 4T 1, then the recombinant vector was transformed into Escherichia coli Rossetta (DE3) induced expression, can obtain a soluble, non inclusion body state, has good active peptide BmKT4. The potassium channel toxin derived polypeptide BmKT4 of the invention can be used to prolong the life span of the nematode Caenorhabditis elegans, increase the number of eggs, and advance the spawning time. The method for preparing BmKT4 according to the invention has the advantages of simple operation, low production cost and simple purification.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种钾离子通道毒素衍生多肽及其制备方法与应用。
技术介绍
东亚钳蝎是我国主要的蝎种，是实验研究最为热点的一个蝎种。蝎毒液成分复杂，毒液毒性较低，各成分之间生理活性多样，具有抗癫、抗栓、抗炎、抗肿瘤、中枢镇痛等重要治疗作用。目前很多有药用价值的蝎毒多肽都是从东亚钳蝎中分离得到的。蝎毒多肽按其作用的离子通道进行分类，可分为：Na+通道、K+通道、Cl-通道和Ca2+通道四种。离子通道不仅直接与兴奋细胞有关，还可进一步影响和控制递质释放、肌肉运动、细胞分裂生殖，甚至对学习及维持细胞内环境稳定也起着重要作用。其中，钾离子通道亚型最多，分布最广，几乎存在于所有的真核细胞并发挥着多种至关重要的生物学功能。多肽药物的研发及多肽先导化合物的发现是一项耗资巨大、风险较高的工程。近年来，以各种理论计算方法和分子模拟技术为基础的计算机辅助设计在各种多肽药物的研发中得到广泛应用。程远国等依据HIV膜融合蛋白gp41的空间结构进行全新设计和合成的抗艾滋病药物西夫韦肽在Ⅰ期、Ⅱ期临床试验中均具有良好的抗病毒效果（MengQ,DongT,ChenX,etal.Pharmacokineticsofsifuvirtideintreatment-naiveandtreatment-experiencedHIV-infectedpatients[J].JPharmSci,2014,103(12):4038-4047.）。多肽药物的成药性高于一般化学药物，其生物活性高、毒性低、可快速消除、副作用小，越来越多的多肽用于临床治疗。但多肽分子也有不足之处，即稳定性较差，在体内易降解，需要连续给药以维持药效，给患者带来不便。计算机辅助设计可以从源头进行多肽链的设计，在保证药效前提下，用其他氨基酸替代易被酶切割的氨基酸从而延长多肽分子的半衰期。天然蝎毒产量极低，其中的活性多肽种类繁多且结构极为相似，单组分分离纯化非常困难，严重的制约其进一步开发研究。采用基因工程方法，用简单的原核或真核生物表达宿主生产具有药用价值的活性多肽的方法显得尤为重要。在世界范围内，已经获得蝎毒基因几百条，然而能够成功进行表达产生有效蝎毒成分的基因却仅有十几条。其难点主要是产量太低，无法进行后序工作、形成不可溶的包涵体、不能正确折叠成为有活性的蛋白质、对表达宿主有毒或者与宿主不匹配而完全不能表达等。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种根据东亚钳蝎钾离子通道毒素通过计算机辅助设计得到的衍生多肽BmKT4及该多肽的编码序列，该多肽含37个氨基酸，水溶性好，生物活性高。本专利技术的另一目的是在于提供钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4的制备方法。该方法简单易行，生产成本低廉，纯化简单。本专利技术的再一目的是在于提供钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4在秀丽线虫产卵及寿命方面的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4，其氨基酸序列如下所示：BmKT4：VGINVTCTNSQQCYNPCGDAGMQYGKCTYGKCHCQPQ（SEQIDNO.1）。编码所述钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4的基因的核苷酸序列优选如下：gtgggcattaacgtgacctgcaccaacagccagcagtgctataacccgtgcggcgatgcgggcatgcagtatggcaaatgcacctatggcaaatgccattgccagccgcagtga（SEQIDNO.2）。所述的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4的制备方法，包括如下步骤：（1）以上述编码BmKT4的基因（SEQIDNO.2）为模板设计含有酶切位点的上、下游引物进行PCR扩增。（2）用限制性内切酶对PCR产物和表达载体pGEX-4T-1分别进行酶切，酶切后的PCR产物和载体通过T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pGEX-BmKT4。（3）连接产物转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞，筛选重组表达载体转化成功的大肠杆菌，得到表达多肽BmKT4的重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-BmKT4。（4）重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-BmKT4通过IPTG（异丙基-β-D-半乳糖苷）诱导及GST亲和层析纯化得到含多肽BmKT4的融合蛋白。步骤（1）中设计的引物优选如下：引物P1：5’-GCCGGATCCGATGACGATGACAAGGTGGGCATTAAC-3’（SEQIDNO.3），该引物含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；引物P2：5’-TATCTCGAGTCACTGCGGCTGGCAATGGCATTTGCC-3’（SEQIDNO.4），该引物含有XhoI限制性内切酶酶切位点。GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高，可生产大量可溶融合蛋白。由于PCR上游引物中含有小肠激酶酶切位点基因序列，这使得重组大肠杆菌表达获得的融合蛋白谷胱甘肽转移酶-蝎钾离子通道毒素衍生多肽中含有了小肠激酶酶切位点，从而通过小肠激酶酶切就可以分开谷胱甘肽转移酶和钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4，以获得不含有额外氨基酸的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4。通过上述方法生产的融合蛋白呈可溶的、非包涵体状态，具有良好的活性。所述的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4在延长秀丽线虫寿命方面的应用。所述的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4在提高秀丽线虫产卵数、使秀丽线虫产卵时间提前方面的应用。本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4水溶性好，生物活性高，能够用于延长秀丽线虫寿命、提高其产卵数、使其产卵时间提前。按照本专利技术方法制备BmKT4简单易行，生产成本低廉，纯化简单。附图说明图1是重组表达载体pGEX-4T-1-钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4（pGEX-BmKT4）的构建示意图。GST表示谷胱甘肽转移酶；P1是上游引物，含有小肠激酶酶切位点和限制性内切酶BamHI酶切位点；P2是下游引物，含有限制性内切酶XhoI酶切位点。图2是SDS-PAGE蛋白质电泳图。泳道1：蛋白质marker（70、55、40、35、25、15kDa）；泳道2：经IPTG诱导的转化空载体pGEX-4T-1的大肠杆菌（Rossetta(DE3)/pGEX-4T-1）全细胞蛋白提取物；泳道3：经IPTG诱导的转化pGEX-BmKT4的大肠杆菌（Rossetta(DE3)/pGEX-BmKT4）全细胞蛋白提取物；泳道4：纯化的GST；泳道5：纯化的融合蛋白GST-BmKT4。图3是多肽BmKT4延长秀丽线虫寿命的结果图。pGEX-4T-1组喂食秀丽线虫经IPTG诱导的大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-4T-1菌体，pGEX-BmKT48组喂食秀丽线虫经IPTG诱导的大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-BmKT4菌体，pGEX-BmKT48组秀丽线虫寿命明显延长。图4是多肽BmKT4促进秀丽线虫产卵的结果图。A为大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-4T-1或Rossetta(DE3)/pGEX-BmKT表达的蛋白对秀丽线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的钾离子通道毒素衍生多肽BmKT4的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）以权利要求2所述的基因为模板设计含有酶切位点的上、下游引物进行PCR扩增；（2）用限制性内切酶对PCR产物和表达载体pGEX-4T-1分别进行酶切，酶切后的PCR产物和载体通过T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pGEX-BmKT4；（3）连接产物转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞，筛选重组表达载体转化成功的大肠杆菌，得到表达多肽BmKT4的重组大肠杆菌；（4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鑫，李文化，徐婕，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42