靶DNA引发的层层自组装石墨烯基光电生物传感器及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于靶DNA引发的层层自组装石墨烯基光电生物传感器检测DNA的方法及应用。本发明专利技术利用DNA分子间的相互作用引发石墨烯自组装，形成层层自组装DNA/石墨烯复合物，在不引入其他金属纳米材料的情况下有效克服了石墨烯的团聚现象，制备得到的层层DNA/石墨烯复合物表现出极好的化学催化活性以及化学稳定性，有利于后续对靶DNA进行电化学及光化学检测；该生物传感器具有制备简便、廉价、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、选择性好等优点。

Layer by layer self assembled graphene based photoelectric sensor triggered by target DNA and detection method and application thereof

The invention discloses a method for detecting DNA by layer by layer self-assembly graphene based photoelectric biosensor based on target DNA and its application. The invention uses the interactions between DNA molecules by self-assembled graphene, forming layers of self-assembled DNA/ graphene composite, in the introduction of other metal nano materials under the condition of effectively overcome the agglomeration of graphene layers of DNA/ graphene composites prepared by chemical showed an excellent catalytic activity and chemical stability that is conducive to the subsequent electrochemical and photochemical detection of target DNA; the biosensor has the advantages of simple preparation, cheap, good stability, high sensitivity, wide linear range, good selectivity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物传感
，具体涉及一种靶DNA引发的层层自组装石墨烯基光电生物传感器及其检测方法和应用。
技术介绍
石墨烯是由碳原子以sp2杂化组成的六边形蜂巢晶格状的单原子薄膜，厚度仅为0.35nm，是目前发现的最薄的二维材料。同时，石墨烯具有一系列优异的物理化学性质，如良好的电子传导性和超高的电子流动性(载流子迁移率达1.5×104cm2·V-1·S-1)、优异的热导性(热导率可达5×103W·m-1·K-1)、较高的机械强度等。基于其所具有的独特性能，石墨烯已被应用于化学修饰电极、化学电源、催化剂、药物载体以及气体传感器等方面的研究。近年来，基于石墨烯制备DNA生物传感器成为生物传感器
研究的热点。然而，由于石墨烯在干燥状态或正常溶剂中均会发生不可逆的团聚，降低了其功效，使其在实际应用中受到一定限制。为了进一步探索基于石墨烯材料的应用价值，近年来科学家在通过金属纳米粒子修饰石墨烯合成石墨烯-金属纳米粒子复合物方面开展了研究工作。中国专利(CN103063715A)公开了一种基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器，该生物传感器根据待测基因片段设计特异性识别探针，捕获探针通过金-硫键自组装于石墨烯/三维纳米金复合物修饰的玻碳电极表面，在目标DNA存在的情况下，捕获探针及末端标记有生物素的信号探针分别与目标DNA结合形成“三明治”结构，从而实现了骨肉瘤相关基因的高灵敏度、高特异性检测。中国专利(CN103033544A)公开了一种基于石墨烯/贵金属复合材料的电化学DNA传感器，所述传感器制备方法为：采用Hummer法由石墨粉制备氧化石墨烯分散水溶液；采用化学还原法制备石墨烯/纳米贵金属粒子复合材料；将石墨烯/纳米贵金属粒子复合材料黏附到玻碳电极上，通过修饰单链DNA，实现修饰电极和目的基因的连接，即制备得到电化学DNA传感器。虽然上述制备方法通过引入金属纳米材料降低了石墨烯的团聚现象，但是上述基于石墨烯制备得到的DNA生物传感器均需首先合成石墨烯-金属纳米粒子复合物，制备过程繁琐、耗时，且往往需要高毒的化学还原剂(如联氨、氢醌等)，制备成本偏高，成功率较低；同时制备得到的DNA生物传感器均为单一电化学生物传感器，检测数据单一，利用率低。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种靶DNA引发的层层自组装石墨烯基光电生物传感器及其检测方法和应用，本专利技术利用DNA分子间以及DNA分子与石墨烯间的相互作用，由靶DNA引发形成层层自组装石墨烯复合结构，同时引入氯高铁血红素(hemin)，利用hemin对亚甲基蓝(MB)-H2O2和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-过氧化氢(H2O2)反应体系的催化作用，同时实现了靶DNA的电化学和紫外-可见吸收检测。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于靶DNA引发的层层自组装DNA/石墨烯复合物，所述层层自组装DNA/石墨烯复合物制备过程如下：(1)将还原氧化石墨烯(GN)超声分散均匀后，分别取两份还原氧化石墨烯分散液，向其中分别加入DNA1、DNA2，室温下反应，制得DNA1/GN、DNA2/GN复合物；其中，所述DNA1为5'端富含AG序列且与靶DNA形成互补度为1/3～1/2的核酸片段，所述DNA2为3'端富含AG序列且与靶DNA形成互补度为1/3～1/2的核酸片段；(2)将步骤(1)得到的DNA1/GN、DNA2/GN复合物混合后，向体系中加入靶DNA(tDNA)，室温下进行层层自组装反应，制得(DNA1/GN-tDNA-DNA2/GN)n结构的层层自组装DNA/石墨烯复合物；优选的，所述步骤(1)中，当所述靶DNA为乙型肝炎病毒(HBV)DNA序列(5'-GAGACCACCGTGAACGCCCACCAA-3')时，所述DNA1的碱基序列为：5'-(AG)15TTGGTGGGCGTT-3'，所述DNA2的碱基序列为：5'-CACGGTGGTCTC(AG)15-3'；当所述靶DNA为TP53DNA序列(碱基序列为：5'-GATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCA-3')时，所述DNA1的碱基序列为：5'-(AG)15TGGGCGGCATGAA-3'，所述DNA2的碱基序列为：5'-CCGGAGGCCCATC(AG)15-3'；当所述靶DNA序列为5'-ATATTGCTGGCGTCTATGGGCGATGTCCTC-3'时，所述DNA1的碱基序列为5'-(AG)15GAGGACATCGCCCAT-3'，所述DNA2的碱基序列为：5'-AGACGCCAGCAATAT(AG)15-3'；优选的，所述步骤(1)中还原氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨烯溶液超声分散后，向其中依次加入氨水和水合肼，将混合物摇匀，利用水合肼的还原作用制备还原氧化石墨烯(GN)；其中所述氨水、水合肼和氧化石墨烯溶液的体积比为1～3：0.15：100，进一步优选为1：0.15：100；所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.4～0.6g/L，进一步优选为0.5g/L；所述还原氧化石墨烯分散液的浓度为0.1mg/mL，所述DNA1与所述石墨烯分散液的质量体积比为5OD：1mL；所述DNA2与所述石墨烯分散液的质量体积比为5OD：1mL；本专利技术还公开了由上述层层自组装DNA/石墨烯复合物构建的靶DNA引发的层层自组装石墨烯基光电生物传感器。一种靶DNA引发的层层自组装石墨烯基光电生物传感器检测DNA的方法，包括：a)在上述制备层层DNA/石墨烯复合物的步骤(2)加入靶DNA后再向其中加入氯高铁血红素(hemin)，从而实现hemin在石墨烯表面的吸附，室温下反应至步骤(2)层层自组装反应完毕；b)将步骤a)得到的产物离心，使反应过程中形成的复合物沉淀，与未连接成功的石墨烯分离，用于后期检测；c)将步骤b)所得的复合物沉淀滴涂在处理过的金电极表面，室温下干燥，使复合物固定在金电极表面；d)将步骤c)制备得到的表面固定有复合物的金电极沉浸在含有亚甲基蓝(MB)的tris-HCl溶液中，进行电化学检测，测定MB的电化学响应信号；e)取步骤b)中的上清液，加入到含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、TMB缓冲液和H2O2的混合溶液中，进行紫外-可见吸收检测。优选的，所述步骤a)中，hemin与石墨烯的质量比为1：8～12，进一步优选为1：10；优选的，所述步骤c)中，金电极的处理方法具体为：先后用0.5μm和0.03μm的Al2O3粉末将金电极打磨成镜面；用二次水清洗后，依次置于乙醇和二次水中超声2～3min；然后用0.5M的浓硫酸对电极进行活化，直到得到稳定的循环伏安扫描图，扫描电压为0.20～1.65V，扫速为0.1V·s-1；最后用二次水冲洗，氮气吹干；优选的，所述步骤d)中，MB溶液的浓度为0.3～0.6mM，tris-HCl的pH为7.2～7.5；进一步优选的，所述MB溶液的浓度为0.5mM，所述tris-HCl的pH为7.4；优选的，所述电化学检测方法为方波伏安法，所述方波伏安法采用三电极工作体系(铂丝电极/金电极/甘汞电极)，参数设置为：电位区间为-0.6V～0V；振幅：2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于靶DNA引发的层层自组装DNA/石墨烯复合物，其特征在于，所述层层自组装DNA/石墨烯复合物制备过程如下：(1)将还原氧化石墨烯超声分散均匀后，分别取两份还原氧化石墨烯分散液，向其中分别加入DNA1、DNA2，室温下反应，制得DNA1/GN、DNA2/GN复合物；其中，所述DNA1为5'端富含AG序列且与靶DNA形成互补度为1/3～1/2的核酸片段，所述DNA2为3'端富含AG序列且与靶DNA形成互补度为1/3～1/2的核酸片段；(2)将步骤(1)得到的DNA1/GN、DNA2/GN复合物混合后，向体系中加入靶DNA，室温下进行层层自组装反应，制得(DNA1/GN‑tDNA‑DNA2/GN)n结构的层层自组装DNA/石墨烯复合物。

【技术特征摘要】
1.一种基于靶DNA引发的层层自组装DNA/石墨烯复合物，其特征在于，所述层层自组装DNA/石墨烯复合物制备过程如下：(1)将还原氧化石墨烯超声分散均匀后，分别取两份还原氧化石墨烯分散液，向其中分别加入DNA1、DNA2，室温下反应，制得DNA1/GN、DNA2/GN复合物；其中，所述DNA1为5'端富含AG序列且与靶DNA形成互补度为1/3～1/2的核酸片段，所述DNA2为3'端富含AG序列且与靶DNA形成互补度为1/3～1/2的核酸片段；(2)将步骤(1)得到的DNA1/GN、DNA2/GN复合物混合后，向体系中加入靶DNA，室温下进行层层自组装反应，制得(DNA1/GN-tDNA-DNA2/GN)n结构的层层自组装DNA/石墨烯复合物。2.如权利要求1所述的一种基于靶DNA引发的层层自组装DNA/石墨烯复合物，其特征在于，当所述靶DNA为乙型肝炎病毒DNA时，所述乙型肝炎病毒DNA序列为5'-GAGACCACCGTGAACGCCCACCAA-3'，所述DNA1的碱基序列为：5'-(AG)15TTGGTGGGCGTT-3'，所述DNA2的碱基序列为：5'-CACGGTGGTCTC(AG)15-3'；当所述靶DNA为TP53DNA时，所述TP53DNA序列为：5'-GATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCA-3'，所述DNA1的碱基序列为：5'-(AG)15TGGGCGGCATGAA-3'，所述DNA2的碱基序列为：5'-CCGGAGGCCCATC(AG)15-3'；当所述靶DNA序列为5'-ATATTGCTGGCGTCTATGGGCGATGTCCTC-3'时，所述DNA1的碱基序列为：5'-(AG)15GAGGACATCGCCCAT-3'，所述DNA2的碱基序列为：5'-AGACGCCAGCAATAT(AG)15-3'。3.如权利要求1所述的一种基于靶DNA引发的层层自组装DNA/石墨烯复合物，其特征在于，所述步骤(1)中还原氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨烯溶液超声分散后，向其中依次加入氨水和水合肼，将混合物摇匀，利用水合肼的还原作用制备还原氧化石墨烯；其中所述氨水、水合肼和氧化石墨烯溶液的体积比为1～3：0.15：100，优选为1：0.15：100；所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.4～0.6g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕赛，孔冬青，王宗花，蔡继宝，郭磊，苏加坤，李景虹，
申请(专利权)人：青岛大学，江西中烟工业有限责任公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：山东;37