一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法技术

一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法，所述粘片剂的成分为每100ml中含鸡蛋清3‑5 mL和糯米粉乳液5‑7 mL，余量为蒸馏水；制备方法为，分别取3~5 mL鸡蛋清和5‑7 mL糯米粉乳液放于烧杯，用无菌水定容至100 mL，混匀，再用0.22µm规格的一次性针头过滤器过滤，滤液即为粘片剂；采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，包括收集菌体、固定、粘片、脱水、置换、临界点干燥、粘台和离子溅射的步骤；本发明专利技术解决了细菌扫描电镜观察实验中的脱片和混杂现象，针对细菌扫描电镜观察实验提供了一种行之有效的粘片剂及其制备方法和制片方法。

Adhesive tablet for producing bacteria scanning electron microscope observation sheet and preparation method thereof

For making a clay tablet and its preparing method of bacteria scanning electron microscope slice, the sticking tablet composition is clear egg containing per 100ml mL and 3 5 glutinous rice powder 7 mL emulsion 5, balance of distilled water; the preparation method, respectively egg and 5 3~5 mL 7 mL glutinous rice powder emulsion placed in the beaker with sterile water and set the volume to 100 mL, mixing, disposable needle filter with 0.22 m specifications, the filtrate as adhesive tablets; preparation method of bacterial morphological observation by SEM slice of the adhesive tablets, including the collection, fixation, cell sticking, dehydration, replacement, critical point drying, fixing and ion sputtering steps; the invention solves the problem of scanning electron microscope and bacteria removal experiment in the phenomenon of mixed bacteria, according to scanning electron microscope experiment provides a effective adhesive tablet and preparation method thereof Production method.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种粘片剂，具体说是一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法。
技术介绍
微生物因为个体微小肉眼无法直接观察，因而对菌体进行显微观测是微生物研究中最基本的一项技能，当运用普通光学显微镜进行形态观察无法达到目的时，还要借助于扫描电子显微镜（扫描电镜）来了解菌体的超微形态特征。细菌是微生物中最为典型的一类生物，传统的细菌扫描电镜观察实验中，尚未见有使用粘片剂的报道，经典的做法都是利用菌体对载玻片自然的黏附作用来完成实验，但这种处理方法菌体的脱片率较高，尤其是在二氧化碳临界干燥环节，因为二氧化碳较长时间的反复冲击，更容易造成部分菌体从载玻片上脱落，从而使二氧化碳干燥仪舱室中不同样品间出现混杂，最终导致错误的观察结果。所以，探索更加有效的细菌扫描电镜观察制片方法，仍然具有广泛的现实意义，实际应用前景广阔。传统的细菌扫描电镜观察制片技术一般也能达到实验目的，但存在的问题也显而易见，这些不足集中体现在：（1）细菌在载玻片上的粘附仅仅依靠细菌细胞壁对载玻片的自然黏附作用，在制片的脱水、置换和二氧化碳干燥环节出现明显的脱片现象；（2）在二氧化碳干燥环节出现脱片现象时，很容易形成不同样品间的混杂。虽然一次只干燥一个样品可以避免混杂情况的出现，但这样大大增加了实验耗时和成本，不利于多个样本实验的开展。
技术实现思路
本专利技术目的是解决细菌扫描电镜观察实验中的脱片和混杂现象，针对细菌扫描电镜观察实验的提供一种行之有效的粘片剂及其制备方法和制片方法。一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂，其成分为每100ml中含糯米粉乳液5-7mL和鸡蛋清3-5mL，余量为蒸馏水；所述糯米粉乳液的制备：称取糯米粉5g，130℃烘干1h后，研钵充分研碎，放入50mL离心管中，加40mL蒸馏水，涡旋振荡器震荡20min后，静置30min，上清液即为糯米粉乳液。用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂的制备方法，包括以下步骤：分别取3-5mL鸡蛋清和5-7mL糯米粉乳液放于烧杯，用无菌水定容至100mL，混匀，再用0.22µm规格的一次性针头过滤器过滤，滤液即为粘片剂，于4℃保存，备用。采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，包括以下步骤：（1）收集菌体：将细菌材料经液体摇床培养24-26h，获取旺盛生长的菌液；取培养好的菌液2ml，移入10ml无菌离心管，离心，弃上清，留沉淀菌体；在沉淀加入5mlpH7.0、0.02mol/L磷酸缓冲液悬浮漂洗5min，离心，再用5ml无菌水漂洗5min，离心得菌体沉淀；（2）固定：向菌体沉淀中加入1.5ml质量浓度2为.5%戊二醛水溶液，轻柔吹吸悬浮菌体，4℃固定6-12h，离心，弃上清，留沉淀，加入2mL粘片剂悬浮菌体；（3）粘片：将1片切割成5-7mm方块的载玻片小片投入步骤（2）的粘片剂菌体悬浮液中，轻轻晃动，使载玻片在菌悬液中翻转1-2次，之后静置5min，用镊子捞出载玻片小片，垂直放置，自然晾干；（4）脱水：将步骤（3）中粘有菌体的载玻片小片依次用梯度叔丁醇，即从低体积浓度梯度叔丁醇到高体积浓度梯度叔丁醇，进行脱水，每个梯度10-15min；（5）置换：向步骤（4）中加入1.5ml乙酸异戊酯置换出菌体中所含的叔丁醇，连续进行两次，每次20-30min。（6）临界点干燥：将步骤（5）载玻片小片放入临界点干燥仪舱室中进行干燥2-2.5h；（7）粘台：将干燥后的载玻片小片直接粘于电镜样品台双面胶上；（8）离子溅射：对粘有菌体材料的载玻片小片进行喷金镀膜后，即得到扫描电镜细菌超微形态观察片，置于扫描电镜中进行观察，拍照。所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，步骤（1）和步骤（2）中所述离心，为6000-10000r/min离心5min。采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，步骤（3）中所述自然晾干的时间为2min以内。采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，步骤（4）所述梯度叔丁醇的体积分数分别为30%、50%、70%、85%、95%、100%，其中体积分数为100%叔丁醇进行脱水2次。有益效果是：1、运用扫描电子显微镜对细菌进行显微观测是掌握和了解未知类群必不可少的研究内容之一，微观形态特征是细菌多相分类的重要依据之一，然而细菌扫描电镜观察实验中，脱片和混杂情况非常普遍。本专利技术提供了一种细菌扫描电镜观察制片方法，丰富了微生物显微观察制片技术途径，在微生物的形态观察实验中具有很强的实用性。2、本专利技术粘片剂不但可以使菌体在载玻片粘附更牢固，也可以使接触的菌体之间黏合的更牢固，这样一来，即便是菌体相互重叠，一些菌体没有与载玻片有效粘连，也不会在二氧化碳临界干燥环节被冲散，使不同样品之间形成混杂，所以，尤其适合多个样品同时进行干燥的情况，也使对菌体浓度的要求更加的宽泛。粘片剂制备质量的好坏，是影响其发挥作用的关键。在制备过程中，几个关键点是：糯米粉烘干温度必须达到130℃、持续时间不超过2h才能有较好的糊化效果；对鸡蛋清的选择最好是选用土鸡蛋的蛋清；过滤除菌要遵循微生物实验无菌操作的一般技术要求。3、本专利技术技术方案目的明确，效果可靠，制备过程通俗易懂，便于操作，既可用作细菌扫描电镜观察制片时的粘片剂，也可以推广到酵母菌、放线菌、真菌孢子等微生物个体的扫面电镜观察实验。粘片剂在具体使用时也可根据实验材料的大小、细胞形态特征等情况适当调整成分用量，以达到最佳的使用效果。4、在本专利技术技术方案原理是，粘片剂中糯米粉主要含有支链淀粉、蛋白质和少量脂肪等天然高分子化合物成分，这些成分干热后发生糊化，高分子之间的相互作用力增强，使得淀粉成分和蛋白成分嵌合更加牢固，形成新的更加致密的网络结构，其胶凝性和稳定性也有较大提高，有利于对微小菌体的黏附固定。鸡蛋清作为粘片剂成分主要是因为其含有纤维状粘蛋白，在粘片剂中，蛋清的纤维状粘蛋白补充糯米粉乳液中的蛋白种类，二者相互配合，可起到更好的胶连作用，提高对菌体的黏附效果。糯米粉乳液和鸡蛋清的混合过程中，必须在室温下进行，因为在高温下，鸡蛋清会提前形成絮状沉淀，失去黏附效果。附图说明图1是本专利技术的实施例1中的长杆型细菌扫描电镜观察效果图；图2是本专利技术的实施例1中的球型细菌扫描电镜观察效果图；图3是本专利技术的实施例1中的鞭毛细菌扫描电镜观察效果图；图4是本专利技术的实施例1中的混杂污染菌扫描电镜观察效果图；其中，图中箭头所指为两种细菌；图5是本专利技术的实施例2中的100000倍扫描电镜下的观察效果图；图6是本专利技术的实施例2中的15000倍扫描电镜下的观察效果图。具体实施方式实施例1采用本专利技术技术示范和验证对不同形态类型细菌的制片观察效果，具体操作如下：（1）粘片剂的制备粘片剂配方（100mL计）：糯米粉乳液6mL，鸡蛋清4mL，蒸馏水定容至100mL。粘片剂制备方法（100mL计）：A．糯米粉乳液的制备：称取糯米粉5g，130℃烘干1h后，研钵充分研碎，放入50mL离心管中，加40mL蒸馏水，涡旋振荡器震荡20min后，静置30min，上清液即为糯米粉乳液。B．粘片剂的制备过程：分别取3-5mL鸡蛋清和5-7mL糯米粉乳液放于烧杯，用无菌水定容至100mL，从分混匀，再用0.22µm规格的一次性针头过滤器过滤，滤液即为制得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂，其特征在于：其成分为，每100ml中含糯米粉乳液5‑7 mL和鸡蛋清3‑5 mL，余量为蒸馏水；所述糯米粉乳液的制备：称取糯米粉5 g，130 ℃烘干1 h后，研钵充分研碎，放入50 mL离心管中，加40 mL蒸馏水，涡旋振荡器震荡20 min后，静置30 min，上清液即为糯米粉乳液。

【技术特征摘要】
1.一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂，其特征在于：其成分为，每100ml中含糯米粉乳液5-7mL和鸡蛋清3-5mL，余量为蒸馏水；所述糯米粉乳液的制备：称取糯米粉5g，130℃烘干1h后，研钵充分研碎，放入50mL离心管中，加40mL蒸馏水，涡旋振荡器震荡20min后，静置30min，上清液即为糯米粉乳液。2.如权利要求1所述粘片剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：分别取3-5mL鸡蛋清和5-7mL糯米粉乳液放于烧杯，用无菌水定容至100mL，混匀，再用0.22µm规格的一次性针头过滤器过滤，滤液即为粘片剂，于4℃保存，备用。3.采用权利要求1所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）收集菌体：将细菌材料经液体摇床培养24-26h，获取旺盛生长的菌液；取培养好的菌液2ml，移入10ml无菌离心管，离心，弃上清，留沉淀菌体；在沉淀加入5mlpH7.0、0.02mol/L磷酸缓冲液悬浮漂洗5min，离心，再用5ml无菌水漂洗5min，离心得菌体沉淀；（2）固定：向菌体沉淀中加入1.5ml质量浓度2为.5%戊二醛水溶液，轻柔吹吸悬浮菌体，4℃固定6-12h，离心，弃上清，留沉淀，加入2mL粘片剂悬浮菌体；（3）粘片：将1片切割成5-7mm方块的载玻片小片投入步骤（...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小东，孙会忠，宋月芹，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41