一种用于肌氨酸的电化学检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肌氨酸的电化学检测方法，包括：利用物理吸附或者化学偶联的方法将肌氨酸氧化酶和第一核酸序列连接；将过氧化物酶和第二核酸序列连接；提供第一核酸纳米结构，其上伸出第一识别序列；提供第二核酸纳米结构，其上伸出第二识别序列；第一核酸序列修饰酶与第一识别序列杂交，得到肌氨酸氧化酶和核酸纳米结构的第一复合体，第二核酸序列修饰酶与第二识别序列杂交，得到过氧化物酶和核酸纳米结构的第二复合体；将第一复合体和第二复合体组装到电化学装置的工作电极表面，进行电化学检测。根据本发明专利技术的电化学检测方法将结构核酸纳米技术、酶催化反应和电化学生物传感器相结合，实现了对肌氨酸小分子的定量检测。

Electrochemical detection method for creatine

The invention relates to a method for the electrochemical detection method, the sarkosine includes: using the method of physical adsorption or chemical coupling of the sarcosine oxidase and the nucleic acid sequence will be connected; peroxidase and second nucleic acid sequence connection; provide the first nucleic acid nano structure, the first out of the recognition sequence; second nucleic acid nano structure, stretched out the first second recognition sequence; modified nucleic acid sequences and the first enzyme recognition sequence hybridization, first sarcosine oxidase complex and DNA nanostructures, second modified nucleic acid sequences and second enzyme recognition sequence hybridization, second complex peroxidase and DNA nanostructures; will be assembled in the first and second complex complex to the working electrode surface electrochemical device, electrochemical detection. According to the electrochemical detection method of the invention, the quantitative detection of the small molecule of the arginine is realized by the combination of the structural nucleic acid nanotechnology, the enzyme catalyzed reaction and the electrochemical biosensor.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因杂交和酶反应检测领域，更具体地涉及一种用于肌氨酸的电化学检测方法。
技术介绍
肌氨酸普遍存在于生物材料中，比如蛋黄、火鸡、火腿、蔬菜、豆制品等。肌氨酸味道偏甜、易溶于水，可以用来作为生物可降解的表面活性剂被用来生产肥皂、牙膏、洗发水、化妆品等，肌氨酸盐也可以抑制某些酶或者细菌的侵蚀，同样被广泛应用到表面修饰或者化妆品的合成中。诸如像化妆品等快销产品，产品配方中每种成分的含量配比等都会影响到产品的性能，因而对产品的所有成分含量的精准控制变得非常重要。肌氨酸作为该类产品中重要的组成部分，对其的精准检测也变得非常重要，有越来越多的化妆品专利被保护起来，这也就使得开发一种简单快速有效的检测手段变得非常有意义。核酸作为一种天然的生物大分子，在纳米尺度上构建功能结构方面具有得天独厚的优势。首先，Watson-Crick碱基配对原则使得核酸序列之间的杂交可以预测；其次，核酸双螺旋结构特性明确，例如：B型DNA的直径和螺旋重复单位分别为大约2纳米和3.4纳米(大约10.5个碱基对)这使得即便是对于最为复杂的DNA纳米结构，构建模型也很简单；第三，核酸结构刚柔兼具。例如：双链DNA的刚性长度大约为50nm，通过双链DNA与相对柔性的单链DNA连接，我们就能得到特定设计的几何结构，并且不影响其稳定性；第四，现代有机化学和分子生物学的发展，允许我们对任意核酸序列进行合成、修饰和复制等；最后，核酸是一种生物相容性很好的材料，可以用与其他生物材料一起构建多组分纳米结构。基于核酸的电化学生物传感器以其快速、灵敏、低成本及易微型化等优点在临床医药、食品检验、环境检测以及反恐等各个领域有着巨大的潜在用途。生物分子检测的灵敏度不仅仅和生物分子的亲和力有关还和传感器的界面性质有关(T.M.Squires,R.J.Messinger,S.R.Manalis,Nat.Biotechnol.2008,26,417-426)。决定电化学生物传感器性能的一个重要的方面就是分子识别界面。核酸纳米结构可以很好地吸附在电极表面，而每一个探针只和一个纳米结构连接，探针之间的空间和相互作用可以通过核酸纳米结构的大小来控制(M.H.Lin,J.J.Wang,G.B.Zhou,J.B.Wang,N.Wu,J.X.Lu,J.M.Gao,X.Q.Chen,J.Y.Shi,X.L.Zuo,C.H.Fan,Angew.Chem.Int.Ed.Engl,2015,54,2151-2155)。同时能够可控地将酶固定在电极表面，提高生物传感器的性能，最大程度地保持酶的活性使之更好地排列在电极的表面(Pei,H.,N.Lu,Y.L.Wen,S.P.Song,Y.Liu,H.Yan,andC.H.Fan,AdvancedMaterials,2010.22(42):4754-4758)。DNA折纸技术同样可以实现不同DNA结构，并且可以控制不同位置伸出DNA序列调控酶在DNA结构上的距离，更好地提高生物传感器的性能。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用于肌氨酸的电化学检测方法，结合酶反应的特异性和电化学检测的高灵敏度、低检测限，构建一种新型的利用酶级联反应和核酸纳米结构的电化学技术来检测前列腺癌靶标小分子肌氨酸的传感器。本专利技术所述的用于肌氨酸的电化学检测方法，包括如下步骤：S1，利用物理吸附或者化学偶联的方法将肌氨酸氧化酶SOX和第一核酸序列连接，得到第一核酸序列修饰酶；将过氧化物酶Peroxidase和第二核酸序列连接，得到第二核酸序列修饰酶；S2，提供第一核酸纳米结构，其上伸出第一识别序列；提供第二核酸纳米结构，其上伸出第二识别序列；S3，第一核酸序列修饰酶与第一识别序列杂交，得到肌氨酸氧化酶SOX和核酸纳米结构的第一复合体，第二核酸序列修饰酶与第二识别序列杂交，得到过氧化物酶Peroxidase和核酸纳米结构的第二复合体；S4，将第一复合体和第二复合体组装到电化学装置的工作电极表面，利用第一复合体中的肌氨酸氧化酶SOX催化肌氨酸生成双氧水，利用第二复合体中的过氧化物酶Peroxidase催化酶催化底物TMB和双氧水的电化学反应，产生电流信号进行电化学检测。所述步骤S1包括：S11，将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP和肌氨酸氧化酶SOX、过氧化物酶Peroxidase进行连接，得到SPDP活化酶；S12，将SPDP活化酶和巯基核酸序列进行反应，得到核酸序列修饰酶，其中，巯基核酸序列是利用巯基对序列为SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸进行修饰的DNA链。所述步骤S11中的SPDP活化酶通过超滤进行纯化，并通过紫外进行定量。所述步骤S12中的SPDP活化酶和巯基核酸序列的摩尔比为1:1-1:50。所述步骤S12中核酸序列修饰酶通过超滤进行纯化，并通过紫外进行定量。所述步骤S2中的核酸纳米结构为一维、二维或三维的DNA纳米结构。所述第一核酸纳米结构为四面体DNA纳米结构，其通过序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5的四条单链DNA自组装形成；所述第二核酸纳米结构为四面体DNA纳米结构，其通过序列为SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5的四条单链DNA自组装形成。所述步骤S4中的第一复合体和第二复合体的摩尔比为0.5:1-20:1。所述步骤S4中的电化学装置的工作电极是由碳电极和金电极组成的平板电极，或由印刷碳电极和印刷金电极组成的薄膜印刷电极。所述步骤S4中的电化学装置的电解槽中加入不含双氧水的酶催化底物TMB和待测肌氨酸样本。根据本专利技术的电化学检测方法将结构核酸纳米技术、酶催化反应和电化学生物传感器相结合，实现了对肌氨酸小分子的定量检测。相对于现有的技术，本专利技术具有如下优点：检测采用的是酶级联反应和电化学结合的方法，检测的特异性高；检测线性范围宽，可以达到0.05uM-10mM；检测限低；采用多通道电化学仪进行检测，检测快速、通量大。附图说明图1是根据本专利技术的实施例1的电化学检测方法的原理图；图2是根据本专利技术的实施例1的SPDP-HRP和巯基DNAL2(linker2)反应不同时间的紫外定量结果，从而说明反应时间对活化的酶和巯基DNA的连接效率有一定的影响；图3是根据本专利技术的实施例1的SPDP-SOX和巯基DNAL1(linker1)反应不同时间的紫外定量结果，从而说明反应时间长可以在一定程度上改善连接效率，但是，无限制地通过延长反应时间来追求连接效率的提高会造成酶活性的下降；图4是根据本专利技术的实施例1的巯基DNAL1和SPDP-SOX反应不同比例对两者连接效率的紫外定量表征；图5是根据本专利技术的实施例1的巯基DNAL2和SPDP-HRP反应不同比例对两者连接效率的紫外定量表征；图6示出根据本专利技术的实施例1，将连接好的L1-SOX和L2-HRP和DNA纳米结构以一定比例混合反应，AFM表征其连接效率，A)为巯基DNA连接的酶和DNA纳米结构(此处为DNA折纸)比例为1：1反应，B)为两者的比例为100：1进行反应的表征；图7是根据本专利技术的实施例1的将两种酶连接四面体以1：1进行混合，然后取混合好的酶连四面体不同浓度组装到电极表面，检测5uM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肌氨酸的电化学检测方法，其特征在于，所述电化学检测方法包括如下步骤：S1，利用物理吸附或者化学偶联的方法将肌氨酸氧化酶SOX和第一核酸序列连接，得到第一核酸序列修饰酶；将过氧化物酶Peroxidase和第二核酸序列连接，得到第二核酸序列修饰酶；S2，提供第一核酸纳米结构，其上伸出第一识别序列；提供第二核酸纳米结构，其上伸出第二识别序列；S3，第一核酸序列修饰酶与第一识别序列杂交，得到肌氨酸氧化酶SOX和核酸纳米结构的第一复合体；第二核酸序列修饰酶与第二识别序列杂交，得到过氧化物酶Peroxidase和核酸纳米结构的第二复合体；S4，将第一复合体和第二复合体组装到电化学装置的工作电极表面，利用第一复合体中的肌氨酸氧化酶SOX催化肌氨酸生成双氧水，利用第二复合体中的过氧化物酶Peroxidase催化酶催化底物TMB和双氧水的电化学反应，产生电流信号进行电化学检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于肌氨酸的电化学检测方法，其特征在于，所述电化学检测方法包括如下步骤：S1，利用物理吸附或者化学偶联的方法将肌氨酸氧化酶SOX和第一核酸序列连接，得到第一核酸序列修饰酶；将过氧化物酶Peroxidase和第二核酸序列连接，得到第二核酸序列修饰酶；S2，提供第一核酸纳米结构，其上伸出第一识别序列；提供第二核酸纳米结构，其上伸出第二识别序列；S3，第一核酸序列修饰酶与第一识别序列杂交，得到肌氨酸氧化酶SOX和核酸纳米结构的第一复合体；第二核酸序列修饰酶与第二识别序列杂交，得到过氧化物酶Peroxidase和核酸纳米结构的第二复合体；S4，将第一复合体和第二复合体组装到电化学装置的工作电极表面，利用第一复合体中的肌氨酸氧化酶SOX催化肌氨酸生成双氧水，利用第二复合体中的过氧化物酶Peroxidase催化酶催化底物TMB和双氧水的电化学反应，产生电流信号进行电化学检测。2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括：S11，将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP和肌氨酸氧化酶SOX、过氧化物酶Peroxidase进行连接，得到SPDP活化酶；S12，将SPDP活化酶和巯基核酸序列进行反应，得到核酸序列修饰酶，其中，巯基核酸序列是利用巯基对序列为SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸进行修饰的DNA链。3.根据权利要求2所述的电化学检测方法，其特征在于，所述步骤S...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，左小磊，宋萍，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31