一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途，其细胞自噬监测探针的结构如下：通过细胞共定位实验确定其能专一的定位于溶酶体上，双光子荧光显微成像实验表明本发明专利技术细胞自噬监测探针对MCF‑7及Hela细胞等渗透性都较好，并能对溶酶体极性的变化适于细胞内定位于溶酶体及检测溶酶体极性的变化情况。本发明专利技术细胞自噬监测探针可以通过即时检测溶酶体内极性的变化来监测细胞的自噬过程。

Autophagy monitoring probe and preparation method and application thereof

The invention discloses a monitoring probe of autophagy and its preparation and use, the structure is as follows: the autophagy monitoring probe to determine the position of the specificity in lysosomes through cellular co localization, two-photon fluorescence microscopy imaging experiments show that the autophagy of MCF 7 monitoring probes and Hela cells the permeability is better, and can change the polarity of lysosomes for intracellular localization in lysosomes and lysosome polarity change detection. The autophagy monitoring probe of the present invention can monitor the autophagy process by detecting the changes of the polarity of the enzyme in vivo.

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种双光子荧光探针，具体地说是一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途。二、
技术介绍
自噬是细胞在受到营养缺乏、氧化应激、高温、损伤等刺激信号时，由一种游离双层膜包裹细胞液或受损的细胞器形成自噬体，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，将内容物降解为氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸从而维持细胞自身稳态效益的过程。自噬可分为4个部分，包括：诱导，自噬小体的形成，自噬小体和溶酶体的膜融合以及自噬溶酶体的降解。细胞自噬作为生物体中一种非常重要的代谢途径，调控过氧化物酶体、线粒体和内质网的不断更新，还能清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚细胞水平的重构，保护受损细胞。目前，一些经典的监测自噬的手段大多基于生物学的角度，如扫描电镜(TEM)，蛋白免疫印迹(WesternBlot)和荧光标记蛋白(GFP-Atg8/LC3)等。这些传统的监测手段都有着其局限性，如扫描电镜和蛋白免疫印迹，它们不能监测活细胞里的自噬状态，同时，这些方法操作都很复杂，花费也很昂贵，对细胞自噬的监测也不是特别的形象。因此，一种能够准确而又经济的自噬监测方法对自噬过程的研究十分必要。溶酶体是真核细胞中的一种细胞器，内含多种水解酶，专司分解各种外源和内源的大分子物质。在自噬过程中，自噬体的膜会和溶酶体膜发生融合，使自噬体内包裹的物质与溶酶体内的水解酶相接触。在这个膜融合的过程中，溶酶体的微环境势必会发生变化，而这个过程中微环境信号的变化为我们提供了一个监测自噬过程的新思路。极性是微环境中的一种重要参数，一些特定的无机有机反应均依赖于极性的参与。在生物系统里，尤其在细胞层面上，极性决定了大多数蛋白质和酶的联系并反映了细胞及细胞器膜组分的通透性，甚至极性的反常变化与一些疾病的产生关系密切。荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号能发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便，灵敏等优点在痕量检测中展现了优越的性能。近些年来，双光子荧光光谱凭借着自身稳定性高，光漂白性好，细胞穿透性高等优点被广泛使用。因此，能够使用双光子荧光探针来检测细胞溶酶体内极性的变化从而实现监测自噬是非常理想的选择。三、
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途。所要解决的技术问题是通过分子设计遴选合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞中溶酶体的微环境变化，具有选择性专一、灵敏度高等优点，细胞毒性测试表明本专利技术对细胞几乎没有毒性作用。本专利技术细胞自噬监测探针(Lyso-OSC)，是以香豆素为母体，4-甲氧基苯乙烯为供电子基团，2-吗啡-1-乙胺为溶酶体定位基团，简称为荧光探针或荧光探针分子，其结构由下式表示：Lyso-OSC本专利技术细胞自噬监测探针的制备方法，包括如下步骤：将7-((4-甲氧基苯基)乙烯)-3-羧酸-香豆素(1g，3mmol)、N,N-二异丙基乙胺(1.2g，9mmol)、1-羟基苯并三唑(0.65g，4.5mmol)、EDC·HCl(0.65g，3.3mmol)以及2-吗啡-1-乙胺(1.2g，9mmol)加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入30mLN,N-二甲基甲酰胺，室温下搅拌反应24h；反应结束后先向反应液中加入50mL二氯甲烷将反应物溶解，再用30mL水萃取(3次)，得到有机相，通过柱层析200-300目硅胶(洗脱液由乙酸乙酯和石油醚按体积比1:1混合构成)，得到目标产物Lyso-OSC0.35g，产率40％。本专利技术荧光探针分子Lyso-OC的合成过程如下：本专利技术荧光探针分子Lyso-OC可在定性检测细胞中溶酶体微环境极性变化时作为检测试剂应用。本专利技术荧光探针分子Lyso-OC可以通过即时检测溶酶体内极性的变化来监测细胞的自噬过程。将本专利技术荧光探针分子溶于DMSO中制得1mM的母液，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同极性(极性参数设置为Δf)的溶剂定容，配制成5μM溶液。荧光探针单光子和双光子的激发波长分别为380nm和760nm，检测390-650nm范围内的荧光光谱变化，可以明显观察到从1,4-二氧六环(极性很小，Δf≈0.09)溶剂极性依次增大到水(极性很大，Δf≈0.32)时，荧光的最大发射峰从470nm红移至525nm(斯托克斯位移约为55nm)，荧光强度也随之降低了约550倍。为了排除溶剂效应的干扰并且进一步研究本专利技术荧光探针与溶剂极性的关系，通过调节水-四氢呋喃中水的含量来控制混合溶剂的极性，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同水含量的水-四氢呋喃混合溶剂定容，配置成5μM溶液。单光子和双光子的激发波长和检测范围均同上，可以观察到水含量从1％(Δf≈0.22)增加到80％(Δf≈0.31)时，荧光的最大发射峰从475nm红移至525nm(斯托克斯位移约为50nm)，荧光强度随之降低了约75倍，荧光量子产率也随之从55％逐渐降低到了约1％，同时荧光寿命也随着极性的增加线性减少。随后，继续研究本专利技术荧光探针在其他不同溶剂的混合体系中(如水-1,4-二氧六环、水-甲醇等)随着极性变化而产生的荧光变化，发现其均呈规律性变化。因此本专利技术荧光探针分子非常有潜力运用于生物检测。为了排除环境pH值对本专利技术荧光探针分子荧光变化情况的影响，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同pH的水定容。单光子和双光子的激发波长和检测范围均同上，可以观察到当环境的pH值从4.8变化到8.0(生物系统中常见的pH范围)时，荧光探针的荧光强度基本没有变化，证明pH值的变化对探针的作用影响非常小，并且能够很好地在生物应用中反映极性的变化。本专利技术荧光探针检测微环境极性变化的机理是在荧光探针分子吸收光子的过程中，由于整个探针分子各个部分偶极矩的不同而导致“溶剂致变色”现象。当溶剂分子包裹在探针分子周围，“溶剂致变色”现象会导致分子在基态和激发态稳定化能的不同。因此，当溶剂极性增加时，探针分子的激发态需要释放更多地能量来内部转换到一个比之前更稳定的激发态(即比之前激发态更低的能级)，甚至可能在一些快速的内部转换之后进一步转换为另一种机理不同却更稳定的激发态(具体为ICT激发态转换为TICT激发态)，这也具体表现为荧光强度减弱或荧光光谱红移。本专利技术荧光探针分子结构简单，易于合成，以荧光强弱和颜色的变化来检测微环境极性的变化，并且对细胞毒性很小，能够用于检测溶酶体内的极性变化，进而监测细胞自噬过程，操作简单，快速灵敏。四、附图说明图1是10μM荧光探针在不同极性的溶剂中的荧光光谱。溶剂包括极性较小的甲苯、1，4-二氧六环等，极性较大的甲醇、水等。图2是10μM荧光探针在不同极性的溶剂中的紫外吸收光谱。包括甲苯、1,4-二氧六环、甲醇和水等。图3是10μM荧光探针在不同水含量的水-四氢呋喃混合体系中的荧光光谱。包括含水10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％。图4是10μM荧光探针在不同水含量的水-四氢呋喃混合体系中的紫外吸收光谱。包括含水10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％。图5是在不同含量(10μM、20μM、30μM)的荧光探针分子的作用下的细胞存活率。图6是荧光探针分子在MCF-7细胞中的溶酶体定位成像图。Lyso-OSC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞自噬监测探针，是以香豆素为母体，4‑甲氧基苯乙烯为供电子基团，2‑吗啡‑1‑乙胺为溶酶体定位基团，其结构由下式表示：

【技术特征摘要】
1.一种细胞自噬监测探针，是以香豆素为母体，4-甲氧基苯乙烯为供电子基团，2-吗啡-1-乙胺为溶酶体定位基团，其结构由下式表示：2.一种权利要求1所述的细胞自噬监测探针的制备方法，包括如下步骤：将7-((4-甲氧基苯基)乙烯)-3-羧酸-香豆素3mmol、N,N-二异丙基乙胺9mmol、1-羟基苯并三唑4.5mmol、EDC·HCl3.3mmol以及2-吗啡-1-乙胺9mmol加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入30mLN,N-二甲基甲酰胺，室温下搅拌反应24h；反应结束后先向反应液中加入50mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，李龙春，江嘉诚，郭蒙蒙，朱满洲，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34