一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料制造技术

本发明专利技术属于生物医用高分子材料领域，公开了一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料及其制备方法和应用。本发明专利技术载体材料结构如通式(1)～(6)：相同或不同的，R1为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R2为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R3为甲基或乙基；R4为羟基；A为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基；通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0<x<1。本发明专利技术阳离子螺旋多肽主链呈α‑螺旋构象，有效与DNA和siRNA形成复合胶束，转染效率好，细胞毒性低，可应用于递送pDNA和siRNA。

Non viral gene transfection vector material based on cationic helical polypeptide

The present invention belongs to the field of biomedical polymer material, and discloses a kind of non viral gene transfection carrier material based on cationic helical polypeptide and its preparation method and application. The present invention carrier material structure as shown in formula (1) ~ (6): the same or different, R1 C1 ~ 6 alkyl, benzyl, polyethylene glycol, polyethylene glycol or poly propylene oxide; R2 C1 ~ 3 alkyl, benzyl or phenyl; R3 is methyl or ethyl; R4 hydroxy A; H, C1 ~ 3 alkyl, alkoxy, halogen or nitro; general formula (1) ~ (4) x, said the degree of polymerization of peptides, the x value of not less than 5; the general formula (5) ~ (6) x, said for side chain repeat unit ratio, 0< x< 1. The invention of cationic polypeptide backbone is alpha helical helical conformation, effectively forming a composite micelles with DNA and siRNA, the transfection efficiency and low cytotoxicity, which can be applied to the delivery of pDNA and siRNA.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医用高分子材料领域，特别涉及一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料及其制备方法和应用。
技术介绍
基因疗法是当今兴起的一种治疗肿瘤和多种免疫疾病的最有前景的技术之一。它将基因当做一种“药物”来治疗疾病，是一种先进的治疗方式。这种疗法可以治疗多种严重疾病，包括各种先天遗传性疾病和后天获得性疾病，例如肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、心血管疾病、囊泡性纤维症等，其中针对肿瘤的治疗是目前研究的热点。基因治疗有两种方式，一种是用外源基因代替细胞内发生紊乱的基因，或者用外源基因修正问题基因，属于DNA疗法；另一种是以精确和特异性的方式使问题基因表达沉默，属于小干扰RNA(siRNA)疗法。从治疗的基本原理看，无论采用那种方法，都需要将治疗基因无降解地穿过目标细胞膜并最终投送到细胞内。因此，选用合适的载体来保护外源基因，从而将基因高效地投递到目标细胞内是基因治疗法成败的关键。“完美”的基因载体材料要满足以下基本标准：其一，载体不能与血管内皮细胞和血液成分发生相互作用；其二，能够避免被网状内皮组织系统吸收；其三，尺度足够小从而能顺利穿过目标细胞膜并到达细胞核。病毒可以满足以上标准，是第一种被用于传递基因的载体，但是缺点太过明显：能引发免疫响应(可能致命)、不能大批量制备、成本高、制备困难、所运载的基因尺寸与病毒通常不匹配。因此，目前的研究目标集中于非病毒类基因载体材料。生理状态下基因带负电荷，因此载体材料通常要求带正电荷，这样静电引力可以自动促成“基因-载体”聚电解质复合胶束的形成，从而达到保护基因的目的。常用的非病毒类载体有阳离子脂质体(例如Lipofectamine)、聚赖氨酸(PLLs)、聚乙烯亚胺(PEI)、树状聚酰胺-胺(PAMAM)，还有磷酸钙颗粒等无机物。除了以上对载体的基本要求外，好的非病毒类载体还要具备二个基本性能：转染效率高和细胞毒性低。阳离子脂质体优点是细胞毒性小，但其分子量小，带正电荷少，负载基因的能力差，保护基因的能力也差，因此稳定性差；PLLs是第一个用于基因转染的聚合物类非病毒载体，缺点是细胞毒性大，另外对DNA的转染能力差；PEI是目前比较流行的高效率转染载体，主要的缺点是分子量大时细胞毒性大、不可生物降解，而分子量小时转染效率又低，这个矛盾是其目前应用的最大障碍；PAMAM和PEI的特点类似，而且制备麻烦，成本高。总体而言，聚合物类非病毒载体材料的分子结构设计灵活，可具备其它载体材料所不能拥有的综合优势，故而是未来发展的目标。因此，设计分子结构合理、采用高效的化学制备技术获得转染效率高、低毒、并有别于传统的PLLs、PEI和PAMAM等聚合物的新型基因转染载体材料无疑是具有创新性的工作。N-羧基环内酸酐(NCAs)开环聚合(ROP)法是制备多肽的一种重要方法，和经典的固相肽合成法相比，可以一次性大批量地制备多肽，但得到的多肽主链只含有一种氨基酸单元，因此是均聚多肽。基于NCAs的开环聚合反应将均聚多肽的侧链改性，可以得到结构和功能多样的多肽材料，它们可以作为天然多肽和蛋白质、甚至糖肽的生物仿生体，在组织工程、药物和基因递送领域应用广泛，具有其它合成聚合物所不能拥有的优点(M.A.Quadir,M.Martin,P.T.Hammond,ChemistryofMaterials,2014,26,461-476；T.J.Deming,ChemicalReviews,2016,116,786-808)。若将均聚多肽侧链接枝上小分子胺类化合物，便可得到阳离子多肽。PLLs是一类典型的阳离子多肽，但是其侧链质子化的氨基距离主链太近，侧链带正电的氨基之间的静电斥力导致PLLs主链的α-螺旋构象解体，因此，PLLs大分子链通常在酸性条件和生理pH下呈无规线团状，但在碱性条件下又变的疏水。J.Cheng等人(H.Lu,J.Wang,Y.Bai,J.W.Lang,S.Liu,Y.Lin,J.Cheng,NatureCommunications,2011,2,1-9)增加侧链质子化氨基与主链的距离，发现侧链的正电荷密度下降，从而不会影响主链构象，这使得多肽继续维持螺旋构象。这种侧链既可以带正电荷，又可以维持非常稳定的螺旋构象的多肽称之为阳离子螺旋多肽(CHPs)。J.Cheng等人(N.PGabrielson,H.Lu,L.Yin,K.H.Kim,J.Cheng,MolecularTherapy,2012,20,1599-1609)进一步研究发现，CHPs不仅可以模拟天然细胞穿透肽(CPPs)的物理化学性质，还可以模拟CPPs的生物活性。和CPPs一样，CHPs也可以不经过细胞内吞作用携带siRNA进入目标细胞，从而避免了siRNA被溶酶体内的核酸酶降解，既提高了转染效率，又克服了CPPs类基因载体的缺陷。J.Cheng等人(N.PGabrielson,H.Lu,L.Yin,D.Li,F.Wang,J.Cheng,AngewandteChemie,2012,124,1169-1173)制备CHPs的基本过程包括四个步骤：首先，合成侧链含苯乙烯结构的L-谷氨酸酯和相应的NCA单体；其次，使NCA单体开环聚合制备侧链含苯乙烯结构的均聚多肽；第三，将侧链苯乙烯的C＝C用臭氧氧化成醛；第四，使侧链醛基和胺类小分子发生还原胺反应，得到CHPs。此制备过程步骤较多，而且使用了连续两次的官能团偶合反应进行侧链改性，效率较低。第三步的侧链氧化和第四步的侧链还原胺反应的时间较长、温度较高、酸度变化大，这些可变因素都有可能导致多肽主链降解。由此鉴之，若在第二步获得多肽后，在温和条件下只使用一步、高效的侧链化学接枝技术制备CHPs，无疑比上述J.Cheng等人的制备方法更有优势。因此，通过这种新的制备方法来获得一类新型的阳离子螺旋多肽类基因转染载体材料，无疑在基因治疗载体领域具有极好的创新性和商业应用潜能。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料。本专利技术另一目的在于提供一种上述基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料的制备方法。本专利技术再一目的在于提供上述基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料在递送pDNA和siRNA中的应用。本专利技术的载体材料为侧链同时含叔胺和仲胺阳离子结构、并具备α-螺旋构象的水溶性阳离子螺旋多肽(CHPs)。其可有效地与质粒DNA和/或小干扰RNA(siRNA)形成聚电解质纳米复合胶束，可向目标肿瘤细胞内传递外源治疗性基因，转染效率好，而且细胞毒性比聚乙烯亚胺(PEI)载体低。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料，其结构如通式(1)～(6)所示：其中R1相同或不同的分别为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R2相同或不同的分别为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R3相同或不同的分别为甲基或乙基；R4为羟基；A相同或不同的分别为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基。通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0<x<1。本专利技术的基于阳离子螺旋多肽的非病毒基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料，其特征在于其结构如通式(1)～(6)所示：其中R1相同或不同的分别为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R2相同或不同的分别为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R3相同或不同的分别为甲基或乙基；R4为羟基；A相同或不同的分别为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基；通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0<x<1。

【技术特征摘要】
1.一种基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料，其特征在于其结构如通式(1)～(6)所示：其中R1相同或不同的分别为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R2相同或不同的分别为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R3相同或不同的分别为甲基或乙基；R4为羟基；A相同或不同的分别为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基；通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0<x<1。2.一种权利要求1所述的基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于包括五步合成反应：(1)合成L-谷氨酸在γ-位的酯化产物；(2)制备N-羧基环内酸酐单体；(3)引发N-羧基环内酸酐单体开环聚合；(4)制备分子结构上同时含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐，或分别含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐；(5)通过光化学点击技术制备阳离子螺旋多肽。3.根据权利要求1所述的基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)α,ω-烯醇或α,ω-炔醇、与L-谷氨酸的γ-位羧基发生酯化反应，生成含C＝C键或C≡C键的L-谷氨酸酯；(2)所得L-谷氨酸酯和三光气发生闭环反应，生成N-羧基环内酸酐单体；(3)利用端伯氨基的分子引发N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到侧链含C＝C键或C≡C键的多肽；(4)利用半胱胺盐酸盐，与含叔胺的醛和/或酮的还原胺反应，合成分子结构上同时含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐，或分别含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐；(5)利用“巯基-烯”和“巯基-炔”光化学点击技术，将所得硫醇类小分子铵盐接枝到所述多肽的侧链，得到阳离子螺旋多肽。4.根据权利要求3所述的基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的α,ω-烯醇为烯丙醇、3-丁烯-1-醇、4-戊烯-1-醇和5-己烯-1-醇中的至少一种；所述的α,ω-炔醇为丙炔醇；所用L-谷氨酸和α,ω-烯醇或α,ω-炔醇的摩尔比为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉刚，易玲，叶国东，黄珺珺，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44