一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点PDANS@Ag/GQDs的电化学发光生物传感器的制备方法及应用，属于新型功能纳米复合材料的制备和生物传感器检测技术领域。基于聚多巴胺纳米微球大的比表面积以及高负载特性，用银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载电化学发光材料石墨烯量子点，从而提高了电化学发光稳定性，用于标记探针pDNA。采用多壁碳纳米管MWCNT负载Pd纳米立方体复合物作为基底材料用于固定凝血酶核酸适配体，通过核酸适配体与目标物的特异性识别功能，成功构建成本低廉、操作简便的信号关闭型电化学发光生物传感器，实现了凝血酶的高灵敏检测。

Preparation method of electrochemiluminescence biosensor based on poly (dopamine) nano microsphere loaded graphene quantum dots

The invention relates to a luminescent biosensor of silver doped poly dopamine nano microspheres supported graphene quantum dot PDANS@Ag/GQDs based on the electrochemical preparation method and application of field preparation and biological sensor detection technology is a new type of functional nano composite materials. Polydopamine nanospheres with high specific surface area and high load characteristics based on the silver doped poly dopamine nano microspheres supported electrochemical luminescence materials of graphene quantum dots, thereby improving the electrochemical luminescence stability for labeled probe pDNA. Using multi walled carbon nanotubes MWCNT supported Pd nano cube complexes as the base material for fixing the thrombin aptamer, through specific recognition of aptamer and target signal, the successful construction of low cost and simple operation closed type light-emitting electrochemical biosensor, realizes the high sensitive detection of thrombin.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法，具体涉及到将石墨烯量子点作为发光材料，利用银掺杂的聚多巴胺纳米微球的高负载性和电化学稳定性负载石墨烯量子点作为标记物，多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体复合物作为基底材料用于固定凝血酶核酸适配体，制备一种检测凝血酶的信号关闭型电化学发光生物传感器，属于新型功能材料与生物传感

技术介绍
由丝氨酸蛋白质水解而成的凝血酶是一种重要的丝氨酸蛋白酶。在人体生理和病理过程中都发挥着重要作用，可以作为相关疾病诊断的生物标识物。衡量凝血机制的重要指标是凝血酶的浓度和活性，对于揭示肿瘤的发生机制及作为早期诊断、治疗、疗效及愈后的判断依据意义重大。电化学发光分析是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或反应的产物与体系中的某种组分发生化学反应，产生激发态物质，激发态物质回到基态时产生发光，根据发光光谱和强度对物质进行痕量分析的一种方法。该法具有灵敏度高、线性范围宽、过程控制性强、选择性好、仪器简单、无放射性等优点；同时，核酸适配体是通过SELEX技术筛选出来的，将筛选出来的适配体作为识别元件与电化学发光传感器相结合，具有适配体的高选择性和特异性结合的优势。本专利技术制备了一种基于银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器。本专利技术采用原位还原的方法，将银纳米粒子原位生长在聚多巴胺纳米微球表面，利用聚多巴胺纳米微球大的比表面积及高负载特性负载大量的石墨烯量子点，不仅实现了石墨烯量子点作为标记物的用途，而且增强了石墨烯量子点的电化学发光稳定性和发光强度，降低了背景信号。多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体复合物作为基底材料用于固定凝血酶核酸适配体，凝血酶核酸适配体与连接有银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点复合物的探针pDNA形成杂交双链，由于凝血酶可以识别凝血酶核酸适配体，从而使得探针pDNA脱离电极表面，导致电化学发光信号的降低，构建了一种信号关闭型电化学发光生物传感器。
技术实现思路
本专利技术目的之一将凝血酶核酸适配体固定在多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体复合物基底上，使凝血酶核酸适配体与连接有电化学放光材料的探针pDNA形成杂交双链。本专利技术的目的之二是用银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载大量的石墨烯量子点作为电化学发光材料，提高电化学发光稳定性与发光强度，降低背景信号。本专利技术目的之三是构建一种灵敏的检测凝血酶的信号关闭型电化学发光生物传感器，通过凝血酶核酸适配体识别凝血酶之后使得连接有电化学发光材料的探针pDNA脱离电极，从而导致信号降低，实现凝血酶的高灵敏、快速地检测。本专利技术的技术方案如下：1.一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法（1）将直径4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）滴加6μL、0.5~1.5mg/mL的MWCNT/Pd纳米立方体溶液至电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）依次滴加10µL0.5~1.5μmol/L凝血酶核酸适配体溶液，3µL质量分数1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性结合位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；（4）滴加10µLpDNA-PDANS@Ag/GQD溶液，在37℃下孵化1~3h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；（5）将电极浸入1×10-14~1×10-11mol/L一系列不同浓度的凝血酶溶液中，在37℃下孵化40min，制得了一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器。2.PDANS@Ag/GQD的制备（1）PDANS@Ag的制备80~120mg盐酸多巴胺加入到80~120mLpH=8.8的Tris-盐酸缓冲溶液与30~70mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500~700mg柠檬酸三钠、20mL0.015~0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应2.5~4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物真空干燥；（2）巯基化GQD的制备称取2g柠檬酸置于100mL烧杯中，将烧杯置于200℃鼓风干燥箱中，5min后柠檬酸开始溶解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30min之后变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用100mL、8~12mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液；分别将13.4~17.4mg巯基乙胺、85.8~105.8mgEDC加入到20mLGQD溶液中，室温下振荡反应24h，将反应后的溶液透析两天，制得巯基化GQD；（3）PDANS@Ag/GQD的制备将1~3mL巯基化GQD溶液与1~3mL浓度为2mg/mLPDANS@Ag溶液混合，室温下震荡12h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD。3.凝血酶的检测（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，将光电倍增管的高压设置为700V，循环伏安扫描电位范围为-1.7~0V，扫描速率为0.1V/s；（2）在10mL、pH7.4的含浓度为0.05mol/LK2S2O8的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的凝血酶产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线。本专利技术的有益成果1多壁碳纳米管负载Pd纳米立方体作为基底材料不仅可以通过Pd-NH2键固定大量的凝血酶核酸适配体，而且具有良好的导电性、大的比表面积和优良的生物相容性。2银掺杂的聚多巴胺纳米微球实现了石墨烯量子点可以作为标记物的用途，降低了背景信号，同时银纳米粒子的引入加快了电子/空穴的注入速率，增强了石墨烯量子点电化学发光响应。3银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的复合物通过Ag-NH2连接探针pDNA，探针pDNA可以识别凝血酶核酸适配体形成杂交双链，由于凝血酶与凝血酶核酸适配体之间的特异性识别作用，使得探针pDNA脱离电极表面从而导致电化学发光信号的降低，实现凝血酶的检测。4本专利技术基于银掺杂的聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点构建了一种信号关闭型电化学发光生物传感器用于凝血酶的检测，操作简单，反应快速，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、灵敏、特异性检测。具体实施方式实施例1一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法（1）将直径4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）滴加6μL、0.5mg/mL的MWCNT/Pd纳米立方体溶液至电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）依次滴加10µL0.5μmol/L凝血酶核酸适配体溶液，3µL质量分数1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性结合位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；（4）滴加10µLpDNA-PDANS@Ag/GQD溶液，在37℃下孵化1h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）滴加6 μL、0.5~1.5 mg/mL的MWCNT/Pd纳米立方体溶液至电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）依次滴加10 µL 0.5~1.5 μmol/L凝血酶核酸适配体溶液，3 µL质量分数1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性结合位点，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；（4）滴加10 µL pDNA‑PDANS@Ag/GQD溶液，在37℃下孵化1~3 h，置于4 ℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；（5）将电极浸入1×10‑14~1×10‑11 mol/L一系列不同浓度的凝血酶溶液中，在37 ℃下孵化40 min，制得了一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）滴加6μL、0.5~1.5mg/mL的MWCNT/Pd纳米立方体溶液至电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）依次滴加10µL0.5~1.5μmol/L凝血酶核酸适配体溶液，3µL质量分数1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性结合位点，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干；（4）滴加10µLpDNA-PDANS@Ag/GQD溶液，在37℃下孵化1~3h，置于4℃冰箱中晾干后用超纯水冲洗电极表面；（5）将电极浸入1×10-14~1×10-11mol/L一系列不同浓度的凝血酶溶液中，在37℃下孵化40min，制得了一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器。2.一种基于聚多巴胺纳米微球负载石墨烯量子点的电化学发光生物传感器的制备方法，所述的PDANS@Ag/GQD制备，其特征在于，包括以下步骤：（1）PDANS@Ag的制备80~120mg盐酸多巴胺加入到80~120mLpH=8.8的Tris-盐酸缓冲溶液与30~70mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500~700mg柠檬酸三钠、20mL0.015~0.035mol/LA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘媛媛，赵彦华，诸宗伟，邢振远，马洪敏，张勇，王欢，魏琴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37