本发明专利技术提供了一种纯化埃博拉病毒抗原蛋白的方法，包括以下步骤：(1)将埃博拉病毒抗原蛋白的表达产物用高盐裂解液重悬，随后进行超声破碎和离心；(2)将离心所得的沉淀，用2mol/L尿素(10mmol Tris pH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(3)然后再用2mol/L尿素(10mmol Tris pH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(4)将离心所得的沉淀用8mol/L尿素(10mmol Tris pH8.0)重悬，离心10分钟；(5)将所得的上清使用DEAE层析纯化；(6)疏水层析纯化；(7)透析复性；(8)强阴离子交换层析；(9)分子筛凝胶过滤；从而得到纯化的埃博拉病毒抗原蛋白。本发明专利技术还提供了由上述方法获得的抗原蛋白和包含其和免疫佐剂的埃博拉病毒疫苗，以及所述抗原蛋白或疫苗在制备用于预防或治疗埃博拉病毒感染的产品中的应用。
【技术实现步骤摘要】
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>本专利技术涉及生物蛋白领域，更具体而言，涉及一种纯化埃博拉病毒抗原蛋白的方法、由此获得的纯化的埃博拉病毒抗原蛋白、包含其的疫苗以及其应用。<
技术介绍
>埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)是烈性传染病埃博拉出血热(EHF)的病原体，为丝状病毒属，非节段单股负链RNA病毒，有5个亚型，即ZaireEbola(ZEBOV)、SudanEbola(SEBOV)、Coted’IvoireEbola(CIEBOV)、BundibugyoEbola(BEBOV)与RestonEbola(REBOV)(Kuhn,JH,Beckeretal.Arch.Virol,2010,155,p2083-2103)。自2014年2月于西非爆发的大规模埃博拉病毒疫情以来至2014年12月17日，世界卫生组织(WHO)发表数据显示，在埃博拉出血热疫情肆虐的利比里亚、塞拉利昂和几内亚等西非三国中感染病例(包括疑似病例)已达19031人，其中死亡人数达到7373人，给这些国家和地区造成了沉重的社会、经济和卫生负担。目前，尚没有高效的疫苗即药物用于埃博拉病毒感染的预防及治疗。埃博拉病毒基因组全长约19Kb，编码7种蛋白质，包括4种结构蛋白(包膜蛋白GP、核糖核蛋白NP、基质蛋白VP24和VP40)、2种非结构蛋白(VP30和VP40)以及病毒RNA聚合酶L。包膜蛋白GP覆盖于病毒颗粒表面，是EBOV唯一的宿主粘附功能蛋白，GP基因对EBOV复制有有独特的编码和转录功能。成熟的GP蛋白以三聚体形式存在，其介导病毒的侵入、免疫逃逸等功能，在介导病毒侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。近年来，随着Ebola病毒致病机制的阐明，Ebola病毒疫苗的研究工作取得了巨大的进展，已研究出了灭活疫苗、DNA疫苗、VEEV复制子疫苗、病毒颗粒疫苗(eVLP)、HPIV3载体疫苗、rAD5载体疫苗、rVSV载体疫苗等。然而，目前存在的Ebola病毒疫苗的有效性较低，获得良好高纯度的活性抗原是制备埃博拉病毒诊断试剂或埃博拉病毒疫苗必须解决的问题。本专利技术人发现，GP蛋白可以诱导宿主产生中和抗体，已有实验证明，高滴度的中和抗体可以有效保护宿主免受病毒的攻击，这为研制高效的疫苗提供了有效途径。然而，GP蛋白是高度糖基化的包膜蛋白，人工表达通常使用真核表达途径，产量低、成本高、工艺复杂。本专利技术人通过对埃博拉病毒GP蛋白进行分析和筛选，建立了针对埃博拉病毒GP蛋白的原核表达及纯化表达工艺，该工艺能够获得具有良好免疫原性的埃博拉病毒抗原蛋白，解决上述问题。<
技术实现思路
>本专利技术的目的是提供一种获得良好、高纯度的埃博拉病毒抗原蛋白。为实现上述目的，本专利技术的第一个方面提供了一种纯化埃博拉病毒抗原蛋白的方法，包括以下步骤：(1)将埃博拉病毒抗原蛋白的表达产物用高盐裂解液重悬，随后进行超声破碎和离心；(2)将离心所得的沉淀，用2mol/L尿素(10mmolTrispH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(3)然后再用2mol/L尿素(10mmolTrispH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(4)将离心所得的沉淀用8mol/L尿素(10mmolTrispH8.0)重悬，离心10分钟；(5)将所得的上清使用DEAE层析纯化；(6)疏水层析纯化；(7)透析复性；(8)强阴离子交换层析；(9)分子筛凝胶过滤；从而得到纯化的埃博拉病毒抗原蛋白。本专利技术的第二个方面提供了通过上述方法获得的纯化的埃博拉病毒抗原蛋白。本专利技术的第三个方面提供了一种埃博拉病毒疫苗，其包含上述纯化的埃博拉病毒抗原蛋白和免疫佐剂，所述免疫佐剂含有具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白，其中所述人工蛋白具有：(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。其中所述人工蛋白的基因具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的核苷酸序列。可选地，该埃博拉病毒疫苗还包含药学上可接受的载体或稀释剂。本专利技术的第四个方面提供了上述纯化的埃博拉病毒抗原蛋白在制备针对埃博拉病毒或埃博拉病毒包膜蛋白GP的免疫原和/或抗原中的应用。本专利技术的第五个方面提供了上述纯化的埃博拉病毒抗原蛋白或埃博拉疫苗在制备用于预防或治疗埃博拉病毒感染的产品中的应用。通过本专利技术的方法纯化的埃博拉病毒抗原蛋白是来自埃博拉病毒包膜蛋白GP的一段，其具有与GP蛋白相似的抗原潜力，通过免疫使机体产生的中和抗体能够有效抑制埃博拉病毒的感染。与完整的GP蛋白抗原相比，本专利技术的纯化的抗原蛋白不仅是高纯度的活性抗原，能够更高效地用于诱导机体产生中和抗体，而且由于其不具有GP蛋白的生物学功能(不具有GP1亚基与GP2亚基的功能，在病毒进入过程中只发挥辅助功能)使得病毒不能进入宿主细胞，从而在用于病毒载体疫苗的构建时具有更好的安全性。<附图说明>图1是示出埃博拉病毒抗原蛋白的载体构建的图。图2是示出根据实施例4和5的埃博拉病毒抗原蛋白的表达结果的电泳图，其中：第3泳道表示实施例4中小量表达中表达量较高的菌株；第4泳道表示实施例5中大量表达的结果。<具体实施方式>本领域技术人员应理解，以下实施例仅用于更好地说明本专利技术，并不意图限制本专利技术的范围。除非特别说明，下述实施例中所使用的实验方法均为常规方法。除非特别说明，下述实施例中所用的材料、酶、试剂、培养基等均可从商业途径得到。实施例1：埃博拉病毒抗原蛋白的表达载体的构建合成与埃博拉病毒抗原蛋白序列(其经过DNA分析和蛋白结构分析进行确认)对应的核苷酸序列，向其中引入NdeI和XhoI酶切位点，以商购的pET30a质粒作为基础载体，构建载体pE-GP。该表达载体表达的蛋白于蛋白C端带有His标签，有利于后期亲和层析纯化。构建载体的步骤是本领域专业人员所熟知的，大致过程如下：1.分别双酶切pET30a质粒和合成的DNA质粒，在200ul的离心管中，加入NdeI和XhoI酶及其缓冲液(按商品说明书)，混匀；37℃下保温2h进行酶切反应。反应结束后，加入2ul10×加样缓冲液(LoadingBuffer)钝化酶活性；(或：65℃下，保温20min使酶失活)。2.电泳并回收目标片段和载体片段，使用T4连接酶按说明书操作连接目标片段与载体，获得pE-GP，见图1。实施例2：大肠杆菌BL21DE3感受态细胞的制备1.从37℃过夜培养的新鲜平皿中挑选大肠杆菌的单个菌落，接种于3ml无抗生素的LB液体培养基，37℃下240rpm振荡培养4～5小时；2.取所得的培养物0.8ml，加到200ml无抗生素的LB培养基中(置于1L三角瓶中)，37℃下240rpm振荡培养至OD600值达到0.45左右；3.将所得的菌体细胞转移到50ml的离心管中，冰浴上放置1.5小时；4.4℃环境下3000rpm离心10分钟，弃去上清，回收细胞，并将管倒置1分钟以使残留的培养液流尽；5.用10ml用冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬菌体沉淀，冰浴10分钟；6.4℃环境下3000rpm离心10分钟，弃去上清，并将管倒置1分钟以使残本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纯化埃博拉病毒抗原蛋白的方法，包括以下步骤：(1)将埃博拉病毒抗原蛋白的表达产物用高盐裂解液重悬，随后进行超声破碎和离心；(2)将离心所得的沉淀，用2mol/L尿素(10mmol Tris pH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(3)然后再用2mol/L尿素(10mmol Tris pH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(4)将离心所得的沉淀用8mol/L尿素(10mmol Tris pH8.0)重悬，离心10分钟；(5)将所得的上清使用DEAE层析纯化；(6)疏水层析纯化；(7)透析复性；(8)强阴离子交换层析；(9)分子筛凝胶过滤；从而得到纯化的埃博拉病毒抗原蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种纯化埃博拉病毒抗原蛋白的方法，包括以下步骤：(1)将埃博拉病毒抗原蛋白的表达产物用高盐裂解液重悬，随后进行超声破碎和离心；(2)将离心所得的沉淀，用2mol/L尿素(10mmolTrispH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(3)然后再用2mol/L尿素(10mmolTrispH8.0)重悬，再次重复进行超声破碎和离心；(4)将离心所得的沉淀用8mol/L尿素(10mmolTrispH8.0)重悬，离心10分钟；(5)将所得的上清使用DEAE层析纯化；(6)疏水层析纯化；(7)透析复性；(8)强阴离子交换层析；(9)分子筛凝胶过滤；从而得到纯化的埃博拉病毒抗原蛋白。2.通过权利要求1所述的方法获得的纯化的埃博拉病毒抗原...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹健荣，林小靖，
申请(专利权)人：德诺杰亿北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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