快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，其特征在于，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH‑Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。本发明专利技术方法简单，所需试剂均为常见，本发明专利技术采用低pH抗性平板，通过两者双重指标大大提高了筛选的效率，扩大筛选范围，提高筛选到高产突变菌株的几率，使生长出的菌株更具代表性，通过细胞生长代谢液经处理后直接配制筛选培养基，筛选底物耐受性菌株，提高细胞对底物的反抑制作用，增强细胞的生长和代谢性能，获得的菌株更具有优势。本发明专利技术所述复筛步骤可以对初筛平板生长的所有菌株进行一步到位复筛，避免漏筛，有效降低筛选工作量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高产乳酸链球菌素的菌株的筛选方法。
技术介绍
乳酸链球菌素(Nisin)，由某些乳酸乳球菌(LactococusLactis)在代谢过程中合成、分泌的具有很强杀菌作用的小肽，又称乳球菌肽或乳链菌肽。Nisin能够抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、乳酸球菌属、梭装芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌抑制作用明显。因此，Nisin可显著的延长食品的保存时间或缩短杀菌所需的时间，在乳制品、肉制品、罐头食品及植物蛋白食品等的保藏于防腐方面都有很好的作用。目前，Nisin研究中存在的主要问题之一是，从自然界中获得的乳酸乳球菌产Nisin的能力普遍较低，要达到工业化应用必须大幅度提高菌株发酵的效价。主要是通过常规的微生物育种或基因工程技术来提高效价。常规育种主要采用紫外线照射、亚硝酸盐处理、低能离子注入及有毒害的化学诱变剂处理。诱变筛选过程中由于正突变的几率很低，要在筛选过程中避免错筛和漏筛，就要建立快速准确高通量的筛选方法。而原有的方法存在工作量大，范围小，等因素，制约了其在大规模筛选高产Nisin的乳酸乳球菌乳酸链球菌株方面的应用。中国专利，ZL.2011100251152，公开了一种高产葡萄糖苷酶的黑曲霉素的筛选方法，但是，该专利提供的技术，可靠性较低，难以工业化应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，以克服现有技术存在的缺陷。本专利技术所述筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH-Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。具体的，包括以下步骤：(1)初筛；(2)复筛；(3)精筛；(4)摇瓶验证实验；所述的步骤(1)的初筛，指的是选择诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种；所述的诱变包括：物理诱变方法，化学诱变方法，或者是物理诱变方法和化学诱变方法结合的方法；所述的乳酸乳球菌是公知的，如保藏号为ATCC11454的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.Lactis)；或者是食品与发酵工业，卷26(5)：19-21文献报道的菌种；并将含有诱变后的乳酸乳球菌加入重量浓度0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有乳酸乳球菌的菌悬液；所述的初筛步骤(1)还包括：a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备、b.乳酸细菌培养基母液的制备、c.高浓度Nisin母液的配制、d.低pH-Nisin抗性平板的制备和e.涂布；所述的a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备，包括如下步骤：将所述的诱变后的乳酸乳球菌在乳酸细菌培养基中，培养6h-48h，然后采用重量浓度为10％-100％的乳酸，调节pH1.5-3.0，静置5-30min，6000-12000rpm离心5-30min，通过0.1-22μm孔径的过滤膜，滤除残余细菌细胞后的过滤液，获得乳酸乳球菌发酵代谢液；所述的乳酸细菌培养基包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.2～1％乙酸钠0.3～0.8％MgSO47H200.02～0.2％柠檬酸氨0.2～0.8％蔗糖4～10％蛋白胨0.6～1.0％酵母粉0.6～1.0％水余量所述的b.乳酸细菌培养基母液的制备：所述的乳酸细菌培养基母液，包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.6～1.0％，乙酸钠0.9～1.2％，MgSO47H200.06～0.1％，柠檬酸氨0.6～1.2％，蔗糖12～24％，蛋白胨3～6％，酵母粉3～6％，琼脂粉6～8％，余量为步骤a获得的乳酸链球菌发酵代谢液；制备方法：将K2HPO4、乙酸钠、MgSO47H20、柠檬酸、蔗糖、蛋白胨、酵母粉和琼脂粉与步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液混合，步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液的重量用量为乳酸乳球菌发酵代谢液总重量的75～85％，然后采用重量浓度为10％-100％的乳酸调节pH4.0-5.5，补加余量的所述的步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液至100％，即可获得乳酸细菌培养基母液；c.高浓度Nisin母液的配制，包括如下步骤：将pH2.0～4.0的水做溶剂，配制Nisin浓度为15mg/mL～50mg/mL(pH2.0～4.0)的溶液，获得高浓度Nisin母液；d.低pH-Nisin抗性平板的制备，包括如下步骤：分别取b步骤的乳酸细菌培养基母液与c步骤的高浓度Nisin母液混合，获得混合物，倒在平板上，如表面皿中，获得含有10.5mgNisin/mL～35mgNisin/mL的低pH-Nisin抗性平板；b步骤的乳酸细菌培养基母液与c步骤的高浓度Nisin母液的混合比例，可根据上述的浓度，方便的得到；术语“10.5mg/mL～35mg/mLNisin”，其中：mg指的Nisin的重量，mL指的是混合物的体积；e.涂布，包括如下步骤：将步骤(1)初筛获得的乳酸乳球菌菌悬液，取100ul涂布于低pH-Nisin抗性平板，30-35℃培养55-72h，同时，涂布普通平板(平板中不含Nisin，且pH为6.8的固体平板)，做对照；所述步骤(2)的复筛方法，包括以下步骤：a.复筛平板的制备：将步骤(1)中，b步骤的乳酸细菌培养基母液补水稀释2～4倍，优选3倍，采用重量浓度为10％-100％的乳酸或者20％NaOH调节pH至4.5～6.8，冷至40-50℃，加入重量浓度为1％～2％的藤黄微球菌悬液，混匀，倒制固体平板，自然冷却固化，获得复筛平板；所述的藤黄微球菌悬液，将藤黄微球菌加入重量浓度为0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有藤黄微球菌的菌悬液；所述藤黄微球菌在藤黄微球菌悬液中的浓度为1×106～3×107cfu/mL；b,在a步骤获得的所述的复筛平板底部，画上边长5-10mm的方格；c,将步骤1中，e步骤获得的低pH-Nisin抗性平板中生长的菌株，接种至复筛平板，30-35℃培养15-24h，同时，接入未经诱变的菌株做对照；本专利技术中，步骤(2)c中所述接种的方法为牙签点种法，通过灭菌牙签将单菌落逐个接入5-10mm方格中，培养后，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程，并斜面保藏；所述步骤(3)的精筛方法，包括以下步骤：a.将液体发酵培养基分装至10mL离心管，每支装5mL；所述的液体发酵培养基，包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.2～0.5％，乙酸钠0.3～0.6％，MgSO47H200.02～0.04％，柠檬酸氨0.2～0.6％，蔗糖4～10％，蛋白胨0.6～1.2％，酵母粉0.6～1.2％，余量为水，将上述组分混合，即可获得所述的液体发酵培养基；b.将复筛得到的高产菌株，分别接种至a步骤的液体发酵培养基，同时，以未经诱变的菌株做对照，30-35℃，150rpm培养15-24h；c.测定发酵结束时的pH、OD600。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000-12000rpm离心10-25min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价，根据效价大小完成精筛步骤，并对优势菌株进行甘油冷冻保藏；所述步骤(4)摇瓶验证实验的方法，是对精筛得到的高产优势菌株进行摇瓶重复发酵验证实验，同时，以未经诱变的菌株做对照，包括以下步骤：a.将液体发酵培养基，分装至50mL锥形本文档来自技高网...

【技术保护点】
快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，其特征在于，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH‑Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。

【技术特征摘要】
1.快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，其特征在于，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH-Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)初筛；(2)复筛；(3)精筛；(4)摇瓶验证实验。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将含有诱变后的乳酸乳球菌加入重量浓度0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有乳酸乳球菌的菌悬液。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的初筛步骤(1)还包括：a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备、b.乳酸细菌培养基母液的制备、c.高浓度Nisin母液的配制、d.低pH-Nisin抗性平板的制备和e.涂布；所述的a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备，包括如下步骤：将所述的诱变后的乳酸乳球菌在乳酸细菌培养基中，培养6h-48h，然后采用重量浓度为10％-100％的乳酸，调节pH1.5-3.0，静置5-30min，6000-12000rpm离心5-30min，通过0.1-22μm孔径的过滤膜，滤除残余细菌细胞后的过滤液，获得乳酸乳球菌发酵代谢液；所述的乳酸细菌培养基包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.2～1％乙酸钠0.3～0.8％MgSO47H200.02～0.2％柠檬酸氨0.2～0.8％蔗糖4～10％蛋白胨0.6～1.0％酵母粉0.6～1.0％水余量；所述的乳酸细菌培养基母液，包括如下重量百分比的组分：K2HPO40.6～1.0％，乙酸钠0.9～1.2％，MgSO47H200.06～0.1％，柠檬酸氨0.6～1.2％，蔗糖12～24％，蛋白胨3～6％，酵母粉3～6％，琼脂粉6～8％，余量为步骤a获得的乳酸链球菌发酵代谢液；所述的高浓度Nisin母液，为Nisin浓度为15mg/mL～50mg/mL(pH2.0～4.0)的溶液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的d步骤中，所述的低pH-Nisin抗性平板，为含有10.5mgNisin/mL～35mgNisin/mL的低pH-Nisin抗性平板。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的e步骤的.涂布，包括如下步骤：将步骤(1)初筛获得的乳酸乳球菌菌悬液，取100ul涂布于低pH-Nisin抗性平板，30-35℃培养55-72h，同时，涂布普通平板，平板中不含Nisin，且pH为6.8的固体平板，做对照。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的复筛方法，包括以下步骤：a.复筛平板的制备：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶贵子，黄青山，
申请(专利权)人：昆山博青生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32