一种石蜡切片样品转换成扫描电镜样品的方法技术

本发明专利技术提供了一种石蜡切片样品转换成扫描电镜样品的方法，所述方法选取动植物组织，经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、切割、脱蜡、喷金，制成适用于扫描电镜观察的样品。该方法能显著提高观察动植物显微结构的放大倍数，为研究动植物细胞显微结构提供支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及将一种石蜡切片样品转换成扫描电镜样品的方法，具体涉及取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、切割、脱蜡、喷金的步骤。
技术介绍
石蜡切片技术是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易区别清楚；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织腐败，而能清晰辨认其形态结构。石蜡切片不仅用于观察动物和植物正常细胞组织的形态结构，也是植物病理学、人体组织斛剖学、人体病理学和法医学等学科用以研究细胞组织的形态变化的常用方法。该技术的优势是对样品要求不高，缺点是操作步骤繁琐，仅限于利用普通光学显微镜观察。扫描电镜是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种表面微观扫描电子显微镜。扫描电子显微镜观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜有以下优点：有较高的放大倍数，10倍到40万倍之间连续可调；有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；试样制备简单。缺点是只能观察样品表面微观形态，而不能观察内部解剖结构。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种动植物组织的石蜡切片转换为扫描电镜样品的方法，本方法能使石蜡切片样品转化成适用于扫描电镜的样品，能提高观察动植物显微结构的放大倍数，为研究动植物细胞显微结构提供支持。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：（1）取材：清理动物、植物样品表面泥土等杂质，切为大小不超过1cm3小块。（2）固定：将样品放入70%的酒精或FAA固定液中，固定液超过样品体积10倍以上，时间超过24小时。（3）脱水：为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，70％、80％、95％至100％完全脱水。（4）透明：组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明，透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净。（5）浸蜡：透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3℃，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃。植物材料切片薄的用熔点为58～60℃的石蜡，切片厚的则用52～54℃的石蜡。（6）包埋：先准备好纸盒，将熔化的蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出,即为包埋块。（7）切片：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块露出2-3mm。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°夹角，包埋块上下边与刀口平行。右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于纸盒内。（8）粘片：将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。（9）切割：用平口玻璃钳子（8英寸200mm）将切片周围空白载玻片切割掉。（10）脱蜡：此步骤为透明的逆过程。由于切片十分薄，处理的时间可以减少，一般每级停留约2～5min。（11）干燥：自然风干即可。（12）喷金：将干燥的样品用导电胶粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50-300Å厚的金属膜。本专利技术的积极效果是：方法简便，提高了观察动植物样品显微结构的放大倍数，又克服了扫描电镜只能观察表面微观结构的缺点，拓宽了扫描电镜的应用范围。附图说明图1：倒生胚珠的双层珠被及由外珠被形成的珠孔×40（普通光学显微镜）；图2：珠心由珠孔端向合点端解体×100（普通光学显微镜）；图3：变形珠被绒毡层×400（普通光学显微镜）；图4：承珠盘×200（普通光学显微镜）；图5：珠被绒毡层中的贮藏物×1500(扫描电镜)；图6：孢原细胞×100(扫描电镜)。具体实施方式一种石蜡切片样品转换成扫描电镜样品的方法，包括以下步骤：（1）取材：清理动物、植物样品表面泥土等杂质，切为大小不超过1cm3小块。（2）固定：将样品放入FAA固定液（70%酒精90ml+冰醋酸5ml+37%~40%甲醛5ml）中，固定液超过样品体积10倍以上，时间超过24小时。（3）脱水：为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，经过70％、80％、95％至100％完全脱水。（4）透明：组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净。（5）浸蜡：透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3℃，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。（6）包埋：先准备好纸盒（高1.5cm长2cm，宽1.5cm），将熔化的蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出,即为包埋块。（7）切片：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块露出2-3mm。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°的夹角，包埋块上下边与刀口平行。右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于纸盒内。（8）粘片：将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石蜡切片样品转换成扫描电镜样品的方法，其特征是：（1）取材：清理动物或植物样品表面的杂质，切为不超过1cm3小块；（2）固定：将样品放入浓度70%的酒精或FAA固定液中，固定液超过样品体积10倍以上，时间超过24小时；（3）脱水：为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高浓度梯度的酒精来进行，即70％、80％、95％至100％完全脱水；（4）透明：将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，透明时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间不超过3h；（5）浸蜡：透蜡在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3℃，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理；纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间每次需15～30min；动物材料的石蜡熔点为52～56℃；植物材料的石蜡熔点为52～60℃；（6）包埋：将熔化的蜡倒入纸盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出，即为包埋块；（7）切片：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形；将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截；将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°的夹角，包埋块上下边与刀口平行；右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于纸盒内；（8）粘片：将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干；（9）切割：用平口玻璃钳子将切片周围空白载玻片切割掉；（10）脱蜡：此步骤为透明的逆过程每级停留2～5min；（11）干燥：自然风干；（12）喷金：将干燥的样品用导电胶粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50 ‑ 300 Å厚的金属膜。...

【技术特征摘要】
1.一种石蜡切片样品转换成扫描电镜样品的方法，其特征是：（1）取材：清理动物或植物样品表面的杂质，切为不超过1cm3小块；（2）固定：将样品放入浓度70%的酒精或FAA固定液中，固定液超过样品体积10倍以上，时间超过24小时；（3）脱水：为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高浓度梯度的酒精来进行，即70％、80％、95％至100％完全脱水；（4）透明：将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，透明时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间不超过3h；（5）浸蜡：透蜡在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3℃，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理；纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间每次需15～30min；动物材料的石蜡熔点为52～56℃；植物材料的石蜡熔点为52～60℃；（6）包埋：将熔化的蜡倒入纸盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈旭辉，曲波，丁锐，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21