重组慢病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组慢病毒及其制备方法和应用，该重组慢病毒含有人端粒酶逆转录酶hTERT基因、cPPT元件和WPRE元件，由四质粒系统包装形成，这四种质粒包括：包装质粒pLP1、包装质粒pLP2、包膜质粒pLP/VSVG和载体质粒。该重组慢病毒的制备方法，包括：构建人端粒酶逆转录酶hTERT基因重组慢病毒表达载体；采用四质粒系统包装携带hTERT基因的重组慢病毒。该重组慢病毒可应用于人细胞永生化。本发明专利技术提供了一种携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒及其制备方法和应用，所提供的重组慢病毒更有利于目的基因整合至宿主细胞染色体，宿主范围更广，拥有多个关键的内置安全特性，对于实现多种类型细胞永生化具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组慢病毒及其制备方法和应用，特别涉及一种携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒及其制备方法和在人细胞永生化中的应用。
技术介绍
端粒(telomere)位于染色体末端，是由串联重复的短双链DNA序列和结合蛋白形成的复合体。端粒保护着染色体末端，使之区别于一般的断裂染色体末端而不被各种酶降解，在维持基因组完整性和功能稳定性方面有着重要作用。细胞分裂时，DNA信息通过复制传递给子代细胞，由于染色体末端不能被复制，端粒在细胞增殖过程中长度会逐渐变短，当端粒变得太短，DNA片段在复制时会遭受破坏，阻止细胞继续增殖。很多科学家猜测，端粒变短可能是生物体老化的原因之一。研究发现，细胞中的一种特殊逆转录酶——端粒酶，能够修补DNA复制的缺陷，使端粒不会因细胞分裂而有所损耗，进而增加细胞分裂的次数。人端粒酶由RNA亚基和至少两个蛋白亚基组成，即：端粒酶相关蛋白1(Telomerase associated protein，TEP1)和人端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT)。端粒酶的活性可以通过调控端粒酶的RNA成分和/或蛋白质成分来实现，其中hTERT作为催化亚基，作用最为重要。端粒酶的催化亚基以端粒酶自己的RNA亚基为模板，通过转位不断重复复制出端粒DNA，补偿在染色体复制过程中的末端隐缩，保证染色体的完全复制。细胞中的端粒酶越活跃，端粒的长度就越能维持。在造血干细胞、生殖细胞和大多数肿瘤细胞中，端粒酶逆转录酶呈高表达；而在正常的人体细胞中呈不表达或低表达。目前普遍认为，表达端粒酶逆转录酶，有助于保持细胞内端粒酶活性，可以使多种类型细胞永生化。哺乳动物细胞表达外源基因可采用质粒转染或病毒载体感染的方法。利用质粒转染获得稳定的转基因细胞需几周甚至几个月时间；而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，将外源基因整合到病毒载体中仅需要几天时间，病毒载体再以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体和慢病毒载体等。慢病毒载体与其它表达载体相比，最大的优势是能够感染分裂和非分裂细胞，将外源基因有效地整合到宿主细胞染色体上，从而实现持久性表达，可以感染干细胞、神经元细胞、心肌细胞、内皮细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组慢病毒，其携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因作为外源基因。本专利技术的又一目的在于提供上述重组慢病毒的一种制备方法。本专利技术的再一目的在于将上述重组慢病毒应用于人细胞永生化。本专利技术提供一种重组慢病毒，其含有人端粒酶逆转录酶hTERT基因、cPPT元件和WPRE元件。-->其中，所述重组慢病毒由四质粒系统形成，这四种质粒包括：包装质粒pLP1、包装质粒pLP2、包膜质粒pLP/VSVG和载体质粒，所述载体质粒携带hTERT基因并至少含有WPRE元件和cPPT元件。其中，所述载体质粒还携带杀稻瘟菌素筛选基因Blasticidin。其中，所述载体质粒由克隆载体pENTR221-hTERT和慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST经由LR反应生成。本专利技术还提供上述重组慢病毒的一种制备方法，包括：步骤一、构建人端粒酶逆转录酶hTERT基因重组慢病毒表达载体：将hTERT基因定向连接至慢病毒表达载体质粒，从而获得重组质粒pLenti6.3/V5-hTERT；步骤二、采用四质粒系统包装携带hTERT基因的重组慢病毒：采用脂质体转染法，将携带hTERT基因的慢病毒表达质粒pLenti6.3/V5-hTERT与包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染至293FT细胞，包装携带hTERT基因的重组慢病毒。本专利技术还包括将上述重组慢病毒应用于人细胞永生化中，可以感染干细胞、神经元细胞、心肌细胞、内皮细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞。通过构建携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒载体，利用慢病毒系统感染目的细胞，将hTERT基因整合至目的细胞染色体，增强细胞内端粒酶逆转录酶的表达，对于实现多种类型细胞的永生化具有重要作用。本专利技术采用λ噬菌体位点特异重组系统将hTERT基因构建至含有cPPT和WPRE元件的慢病毒表达载体质粒，并将所得到重组质粒命名为pLenti6.3/V5-hTERT，将该重组载体质粒与病毒包装质粒混合物共转染人胚肾293FT细胞，收集细胞培养上清液，经过病毒浓缩、PCR扩增检测、重组慢病毒对HeLa细胞的感染性能检测和hTERT基因在HeLa细胞中的表达检测，最终在293FT细胞中成功包装出携带hTERT基因的重组慢病毒。本专利技术提供的重组慢病毒对于实现多种类型细胞永生化具有重要作用。本专利技术所涉及的重组慢病毒由四质粒系统形成，这四种质粒包括：pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLenti6.3/V5-hTERT。pLP1质粒表达形成慢病毒结构所必需的gag基因以及病毒复制和整合必需的pol基因；pLP2质粒表达Rev蛋白，它能与pLP1上的反应元件(PRE)共同作用诱导Gag/Pol表达，并指导病毒RNA的核运输；pLP/VSVG表达水泡炎病毒G糖蛋白(VSV-G)，使宿主范围更广；携带hTERT基因的重组质粒pLenti6.3/V5-hTERT，含有WPRE、cPPT元件和杀稻瘟菌素筛选基因Blasticidin，同时提供Ψ包装信号以及PRSV/5’LTR和ΔU3/3’LTR，便于病毒包装。这四个质粒必须共同作用，才能产生有感染能力的病毒颗粒。本专利技术所涉及的慢病毒表达系统拥有多个关键的内置安全特性，包括：以反式方式提供HIV的包装功能，避免非预期的重组；在慢病毒包装混合物(pLP1、pLP2、pLP/VSVG)中不含LTR，所以包装载体不会包装成病毒颗粒；系统中产生的病毒颗粒不能复制，只能用来装载目的基因，不会产生其他的病毒颗粒；慢病毒载体经过修饰，已被自灭活，当转染和整合后不能再产生可包装的病毒基因组。本专利技术所构建的重组慢病毒表达载体质粒pLenti6.3/V5-hTERT来源于慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST，与具有类似功能的pLenti6/V5-DEST相比，pLenti6.3/V5-DEST增加了两个新元件——WPRE和cPPT。WPRE来自土拨鼠肝炎病毒，能加强转基因的表达；cPPT来自HIV-1整合酶基因，能增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数。这两个元件共-->同作用，能使大多数细胞中的蛋白表达量至少增加4倍。因此，本专利技术所提供的重组慢病毒更有利于目的基因整合至宿主细胞染色体。综上，本专利技术提供了一种携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒及其制备方法和应用，所提供的重组慢病毒更有利于目的基因整合至宿主细胞染色体，宿主范围更广，拥有多个关键的内置安全特性，对于实现多种类型细胞永生化具有重要作用。附图说明下面结合附图，通过对本专利技术的具体实施方式详细描述，将使本专利技术的技术方案及其他有益效果显而易见。附图中，图1所示为pENTR221-hTERT克隆载体(购自Invitrogen公司)，其内含有hTERT基因；图2所示为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组慢病毒，其特征在于含有人端粒酶逆转录酶hTERT基因、cPPT元件和WPRE元件。

【技术特征摘要】
1.一种重组慢病毒，其特征在于含有人端粒酶逆转录酶hTERT基因、cPPT元件和WPRE元件。2.根据权利要求1所述的重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由四质粒系统形成，这四种质粒包括：包装质粒pLP1、包装质粒pLP2、包膜质粒pLP/VSVG和载体质粒，所述载体质粒携带hTERT基因并至少含有WPRE元件和cPPT元件。3.根据权利要求2所述的重组慢病毒，其特征在于，所述载体质粒还携带杀稻瘟菌素筛选基因Blasticidin。4.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述载体质粒由克隆载体pENTR221-hTERT和慢病毒表达载体pLenti6.3/V5...

【专利技术属性】
技术研发人员：高书颖，于洁，尹美珺，
申请(专利权)人：北京大学深圳医院，
类型：发明
国别省市：广东;44