本发明专利技术涉及一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇(PEG-dithiol)残留的检测方法，依据Ellman’s试剂与巯基反应生成的化合物与PEG-dithiol的含量在412nm处呈线性关系的原理建立了一种操作简单、快速的交联凝胶中PEG-dithiol残留的检测方法。该检测方法在40-200μg/ml范围内具有良好的线性关系,尤其可用于大分子交联凝胶的检测。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及生物化学、药物化学与药物分析
，具体涉及一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的方法。
技术介绍
：二巯基聚乙二醇，在目前公开的文献中，尚无其毒理数据。鉴于产品的使用安全性考虑，有必要对产品中残留的PEG-dithiol进行残留量限度检测。目前未有文献报道此物质含量或残余量的检测方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的检测方法，以解决二巯基聚乙二醇残留所导致的安全性问题，该方法检测准确，检验成本、检验效率高、检验工作开展方便。为实现本专利技术的目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)磷酸盐缓冲液的制备：取无水磷酸氢二钠912mg，一水合磷酸二氢钠300mg,加水使溶解成500ml，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；(2)PEG-dithiol对照品溶液的制备：精密称取二巯基聚乙二醇对照品40mg，置20ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成浓度为0.4mg/ml的PEG-dithiol对照品溶液；(3)醋酸盐缓冲液的制备：取11.55ml冰醋酸，定容至1000ml，得到浓度为0.2mol/L醋酸；称取16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1000ml水中，得到浓度为0.2mol/L醋酸钠；取148ml浓度为0.2mol/L醋酸溶液与352ml浓度为0.2mol/L醋酸钠溶液混匀，得到pH为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液；(4)酶溶液的制备：称取simga公司出品的809U/mg透明质酸酶30mg，加pH值为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液溶解制成10ml酶溶液；(5)样品溶液制备：取交联透明质酸钠凝胶1.0g，加1.0ml步骤(4)制备的酶溶液，置37℃降解2.0h，使凝胶降解成样品溶液备用；(6)反应缓冲液制备：称取35.814g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液；称取15.601g二水合磷酸二氢钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液；吸取9.32ml的浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液加水稀释至90ml，混匀，用氢氧化钠试液调pH值至8.0，加水定至100ml，得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液；称取0.03724gEDTA至pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液中，混匀，得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L反应缓冲液；(7)DTNB溶液的制备：称取40mgDTNB，加步骤(6)制备的反应缓冲液溶解制成DTNB溶液备用；(8)标准曲线的制备：精密量取步骤(2)制备的PEG-dithiol对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml置1.5ml离心管中，依次加入pH值为7.4磷酸盐缓冲液至1.0ml，混匀；分取上述溶液各0.5ml，加0.5ml步骤(4)制备的酶溶液，混匀，37℃放置约2.0h，再分别步骤(6)制备的反应缓冲液5.0ml，涡旋混匀，加入步骤(7)制备的DTNB溶液0.2ml，混匀，室温放置15分钟；以对照品溶液0ml经上述方法制备的溶液为空白，在412nm的波长处测定吸光度，以对照品溶液的浓度对相应的吸光度计算回归方程；(9)交联透明质酸钠凝胶PEG-dithiol残留的测定：取步骤(5)制备所得的样品溶液1.0ml，按步骤(8)加入步骤(6)制备的反应缓冲液和步骤(7)制备的DTNB溶液反应15分钟，在412nm的波长处测定吸光度，根据回归方程计算交联透明质酸钠凝胶中PEG-dithiol的残留。在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(4)中制备的酶溶液为2400U/ml酶溶液。在本专利技术的一个优选实施例中，可测定的PEG-dithiol的分子量为3400Da。本专利技术的二巯基聚乙二醇的检测方法的检测原理根据二巯基聚乙二醇中含有的巯基与DTNB溶液发生反应，产生黄色化合物，此化合物在412nm处会产生最大吸收。利用本专利技术的方法检测测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留，弥补目前二巯基聚乙二醇作为交联剂无法监控其残留量的缺点，特别适合大分子交联凝胶残留的检测。具体实施方式通过下面给出的本专利技术的具体实施例可以进一步清楚地了解本专利技术，但它们不是对本专利技术的限定。实施例1(1)磷酸盐缓冲液的制备：取无水磷酸氢二钠912mg，一水合磷酸二氢钠300mg,加水使溶解成500ml，得到pH7.4的磷酸盐缓冲液。(2)PEG-dithiol对照品溶液的制备：精密称取二巯基聚乙二醇对照品40mg，置20ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置25ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至刻度，制成约0.4mg/ml的对照品溶液。(3)醋酸盐缓冲液的制备：取11.55ml冰醋酸，定容至1000ml，得到0.2mol/L醋酸；称取16.4g无水醋酸钠溶于1000ml水中，得到0.2mol/L醋酸钠；取148ml0.2mol/L醋酸溶液与352ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀，得到0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)。(4)酶溶液的制备：称取透明质酸酶(simga公司809U/mg)约30mg，加0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)溶解并使成10ml。(5)样品溶液制备：取交联透明质酸钠凝胶约1.0g，加1.0ml酶液，置37℃降解约2.0h，使凝胶降解成溶液备用。(6)反应缓冲液制备：称取35.814g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解使成100ml，得到1mol/L磷酸氢二钠溶液；称取15.601g二水合磷酸二氢钠，加水溶解使成100ml，得到1mol/L的磷酸二氢钠溶液；吸取9.32ml的1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的1mol/L的磷酸二氢钠溶液加水稀释至约90ml，混匀，用氢氧化钠试液调pH至8.0，加水定至100ml，得到0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)溶液；称取0.03724gEDTA至0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)溶液中，混匀本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)磷酸盐缓冲液的制备：取无水磷酸氢二钠912mg，一水合磷酸二氢钠300mg,加水使溶解成500ml，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；(2)PEG‑dithiol对照品溶液的制备：精密称取二巯基聚乙二醇对照品40mg，置20ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成浓度为0.4mg/ml的PEG‑dithiol对照品溶液；(3)醋酸盐缓冲液的制备：取11.55ml冰醋酸，定容至1000ml，得到浓度为0.2mol/L醋酸；称取16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1000ml水中，得到浓度为0.2mol/L醋酸钠；取148ml浓度为0.2mol/L醋酸溶液与352ml浓度为0.2mol/L醋酸钠溶液混匀，得到pH为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液；(4)酶溶液的制备：称取simga公司出品的809U/mg透明质酸酶30mg，加pH值为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液溶解制成10ml酶溶液；(5)样品溶液制备：取交联透明质酸钠凝胶1.0g，加1.0ml步骤(4)制备的酶溶液，置37℃降解2.0h，使凝胶降解成样品溶液备用；(6)反应缓冲液制备：称取35.814g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液；称取15.601g二水合磷酸二氢钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液；吸取9.32ml的浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液加水稀释至90ml，混匀，用氢氧化钠试液调pH值至8.0，加水定至100ml，得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液；称取0.03724g EDTA至pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液中，混匀，得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L反应缓冲液；(7)DTNB溶液的制备：称取40mg DTNB，加步骤(6)制备的反应缓冲液溶解制成DTNB溶液备用；(8)标准曲线的制备：精密量取步骤(2)制备的PEG‑dithiol对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml置1.5ml离心管中，依次加入pH值为7.4磷酸盐缓冲液至1.0ml，混匀；分取上述溶液各0.5ml，加0.5ml步骤(4)制备的酶溶液，混匀，37℃放置约2.0h，再分别步骤(6)制备的反应缓冲液5.0ml，涡旋混匀，加入步骤(7)制备的DTNB溶液0.2ml，混匀，室温放置15分钟；以对照品溶液0ml经上述方法制备的溶液为空白，在412nm的波长处测定吸光度，以对照品溶液的浓度对相应的吸光度计算回归方程；(9)交联透明质酸钠凝胶PEG‑dithiol残留的测定：取步骤(5)制备所得的样品溶液1.0ml，按步骤(8)加入步骤(6)制备的反应缓冲液和步骤(7)制备的DTNB溶液反应15分钟，在412nm的波长处测定吸光度，根据回归方程计算交联透明质酸钠凝胶中PEG‑dithiol的残留。...
【技术特征摘要】
1.一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方法，其特征在
于，包括以下步骤：
(1)磷酸盐缓冲液的制备：取无水磷酸氢二钠912mg，一水合磷酸二氢
钠300mg,加水使溶解成500ml，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
(2)PEG-dithiol对照品溶液的制备：精密称取二巯基聚乙二醇对照品
40mg，置20ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，
摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至
刻度，制成浓度为0.4mg/ml的PEG-dithiol对照品溶液；
(3)醋酸盐缓冲液的制备：取11.55ml冰醋酸，定容至1000ml，得到浓
度为0.2mol/L醋酸；称取16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于
1000ml水中，得到浓度为0.2mol/L醋酸钠；取148ml浓度为0.2mol/L醋酸
溶液与352ml浓度为0.2mol/L醋酸钠溶液混匀，得到pH为5.0、浓度为
0.2mol/L醋酸盐缓冲液；
(4)酶溶液的制备：称取simga公司出品的809U/mg透明质酸酶30mg，
加pH值为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液溶解制成10ml酶溶液；
(5)样品溶液制备：取交联透明质酸钠凝胶1.0g，加1.0ml步骤(4)
制备的酶溶液，置37℃降解2.0h，使凝胶降解成样品溶液备用；
(6)反应缓冲液制备：称取35.814g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解使
成100ml，得到浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液；称取15.601g二水合磷酸二
氢钠，加水溶解使成100ml，得到浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液；吸取
9.32ml的浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的浓度为1mol/L的磷酸二
氢钠...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶湘武，曹邦静，付爱玲，罗斌，
申请(专利权)人：上海景峰制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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