本发明专利技术涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，如，基于免疫球蛋白结合蛋白的配体，如，葡萄球菌A蛋白，以及制备和使用所述配体的方法。
【技术实现步骤摘要】
相关申请本申请要求申请号为No.61/203,664，申请日为2008年12月24日的美国临时专利申请的优先权，其全部内容在此全部并入本申请。
本专利技术涉及具有提高的腐蚀稳定性的色谱分析用配体，例如，基于免疫球蛋白结合蛋白(如，葡萄球菌A蛋白)的配体，以及包含此类配体的色谱分析基质。
技术介绍
在亲和色谱分析中使用的配体通常赋予对靶分子的高选择性，因此导致了对靶分子的高收率以及快速而经济的纯化。基于葡萄球菌A蛋白(SpA)的试剂以及色谱分析基质达到了在捕获和纯化抗体的亲和色谱分析中的广泛应用，并且由于其结合IgG而对免疫球蛋白和抗体的亲和性没有显著影响的能力，其同样广泛应用于抗体检测方法。据此，已经开发了多种包含A蛋白—配体的试剂以及介质，并且在商业上可获得，包括，例如，ProSep-vA High Capacity，ProSepvA Ultra和ProSepUltraPlus(Millipore)及Protein A SepharoseTM，MabSelectTM，MabSelect XtraTM和MabSelect SuRe(GE Healthcare)和Poros MabCaptureATM(Applied Biosystems)。为了维持色谱分析用配体(所述配体包括，如，包含基于SpA的色谱分析用配体的树脂)的选择性和结合能力，需要对配体结合树脂(称作色谱分析基质)进行清洁，并且通常在碱性条件下清洗，如，使用氢氧化钠。举例来说，用于清洗和复原基质的标准过程是一种原位清洗(Cleaning-in-place，CIP)的碱性方案，一般包括使用pH14的1M NaOH对基质进行处理。但是，这种不太温和的处理经常是不期望的，当配体是一种蛋白或是基于蛋白的分子时尤其如此。
技术实现思路
本专利技术提供了具有碱稳定性的基于SpA的色谱分析用配体，例如，其能够耐受重复的原位清洗(CIP)循环。更特别的是，基于本专利技术的配体可以在延长的时间中耐受传统的碱性清洗，这使得所述配体成为引人注目的候选物，特别是对于免疫球蛋白进行低成本高效率且高水平的纯化而言尤为如此。在本专利技术的一个方面，碱稳定性色谱分析用配体包含两个或更多个SpA结构域。例如，在这方面的一些实施方式中，提供了碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SPA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述两个或更多个B结构域或者两个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在基于该方面的一些实施方式中，所述配体包含三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的B结构域或者三个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，所述三个-->或更多个B结构域或者三个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在另一些实施方式中，所述配体包含四个或更多个SpA B结构域或者四个或更多个SpA Z结构域，所述四个或更多个B结构域或四个或更多个Z结构域被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。在其它实施方式中，所述配体包含五个或更多个SpA B结构域或五个或更多个SpA Z结构域；或包含六个或更多个SpA B结构域或六个或更多个SpA Z结构域；或包含七个或更多个SpA B结构域或七个或更多个SpA Z结构域，所述五个或更多个B结构域或五个或更多个Z结构域，六个或更多个B结构域或六个或更多个Z结构域，七个或更多个B结构域或七个或更多个Z结构域，被附着在色谱分析树脂上，附着位点为树脂上的多于一个位点。基于本专利技术的另一方面，碱稳定性色谱分析用配体包含一个或多个分离的葡萄球菌A蛋白E、D、A、B、C或Z结构域，所述一个或多个分离的结构域包含位于n+1位的一个或多个突变为除半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)之外的任何天然存在的氨基酸的氨基酸残基。在一些实施方式中，n代表分离的SpA结构域的23位天冬酰胺残基。在分离的SpA结构域的24位具有突变的示例性配体如表1所示，其中n代表天冬酰胺。表1 包含修饰的SpA结构域 名称 E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被甲 硫氨酸取代 E-D24M D-E24M A-E24M B-E24M C-E24M Z-E24M E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被异 亮氨酸取代 E-D24I D-E24I A-E24I B-E24I C-E24I Z-E24I E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被苯 丙氨酸取代 E-D24F D-E24F A-E24F B-E24F C-E24F Z-E24F--> 包含修饰的SpA结构域 名称 E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被苏 氨酸取代 E-D24T D-E24T A-E24T B-E24T C-E24T Z-E24T E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被脯 氨酸取代 E-D24P D-E24P A-E24P B-E24P C-E24P Z-E24P E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被色 氨酸取代 E-D24W D-E24W A-E24W B-E24W C-E24W Z-E24W E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被精 氨酸取代 E-D24R D-E24R A-E24R B-E24R C-E24R Z-E24R--> E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被缬 氨酸取代 E-D24V D-E24V A-E24V B-E24V C-E24V Z-E24V E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被亮 氨酸取代 E-D24L D-E24L A-E24L B-E24L C-E24L Z-E24L E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被酪 氨酸取代 E-D24Y D-E24Y A-E24Y B-E24Y C-E24Y Z-E24Y E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被组 氨酸取代 E-D24H D-E24H A-E24H B-E24H C-E24H Z-E24H E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被赖 氨酸取代 E-D24K D-E24K A-E24K B-E24K C-E24K Z-E24K--> E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被缬 氨酸取代 E-D24V D-E24V A-E24V B-E24V C-E24V Z-E24V E、D、A、B、C或Z结构域-24位的谷氨酸或24位的天冬氨酸被谷 氨酸取代 D-E24D A-E24D B-E24D C-E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域。
【技术特征摘要】
2008.12.24 US 61/203,6641.一种碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域。2.一种碱稳定性色谱分析用配体，所述配体包含两个或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)或其功能性片段或变体的B结构域或者两个或更多个SpA或其功能性片段或变体的Z结构域，其中所述两个或更多个B结构域或者两个或更多个Z结构域在色谱分析树脂的多于一个位点上附着于树脂。3.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含三个或更多个SpA B结构域或者三个或更多个SpA Z结构域。4.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含四个或更多个SpA B结构域或者四个或更多个SpA Z结构域。5.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含五个或更多个SpA B结构域或者五个或更多个SpA Z结构域。6.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含六个或更多个SpA B结构域或者六个或更多个SpA Z结构域。7.权利要求1或者权利要求2的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述配体包含七个或更多个SpA B结构域或者七个或更多个SpA Z结构域。8.前述权利要求任一项的碱稳定性色谱分析用配体，进一步包括至少一个氨基酸的突变以改变与Fab的结合。9.权利要求8的碱稳定性色谱分析用配体，其中所述突变包括在第29位丙氨酸取代甘氨酸。10.一种色谱分析基质，包含权利要求1-9任一项所述的配体。11.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供含有一种或多种免疫球蛋白的样品；(b)在一种或多种免疫球蛋白同基质结合的条件下，将样品与权利要求10的基质接触；和(c)通过在适宜的条件下洗脱而回收一种或多种结合的免疫球蛋白。12.权利要求1-9任一项所述的配体，其中所述配体在0.5M NaOH中温...
【专利技术属性】
技术研发人员：N·卞，N·索伊斯，S·斯佩克特，K·莱文，
申请(专利权)人：米利波尔公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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