一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法技术

技术编号:15087545 阅读:91 留言:0更新日期:2017-04-07 17:18
本发明专利技术涉及一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法。该方法包括陈化烟叶表面真菌富集和基因组DNA的提取两个主要步骤,通过缓冲液浸泡和梯度离心富集真菌,经液氮研磨破壁,采用试剂盒提取真菌基因组DNA。液氮研磨可充分裂解真菌细胞壁,提高真菌DNA的提取效率,包含了创新专利抑制因子去除可有效提高基因组的获得率。本发明专利技术方法能够有效,快速的提取陈化烟叶表面真菌的基因组DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物学领域,具体涉及一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法。
技术介绍
新鲜的烤烟烟叶成熟后采集进行初烤,再经过打叶复烤等处理后进入陈化阶段,陈化阶段能够调整、改善烟叶品质,保持烟叶质量的稳定性,是卷烟生产中必不可少的处理阶段。进行陈化处理的烟叶表面和内部寄附了丰富的微生物,并且陈化中的烤烟烟叶富含各类化合物,包括糖类、蛋白质、烟碱等,满足微生物生存的营养条件,烟叶内的许多物质具有亲水性,能够从陈化环境中吸收水分,在合适条件下,导致烤烟烟叶表面上滋生大量的微生物,细菌、霉菌是主要的两大类群。在烟叶陈化发酵过程中,微生物作用扮演着重要的作用,微生物和它们分泌的酶能够缩短烟叶发酵时间、转化或降解烟叶中影响烟叶品质的大分子化合物、降低烟碱含量和增加香气含量等。各类真菌存在于陈化的各个阶段,这些真菌在繁衍中能够减少烟叶中的烟碱等有害物质的含量,同时,真菌产生的酶还能促成各类化学反应的进行,产生许多具有特殊气味的香料物质。然而,真菌的菌丝和孢子在适宜的环境条件下会不断生长、繁殖,造成烟草的大量霉变,从而丧失制烟价值,影响烟叶品质。所以研究烟叶上真菌来提高烟叶品质和降低其对烟叶的危害具有较大的实践意义。对于烟草微生物的研究,传统的纯培养研究方法具有很大的局限性,环境中拥有大量的微生物,但可培养的微生物只占1%左右,而大部分的微生物是无法通过培养获得的。许多学者利用宏基因组的方法,直接从样品中获取样品的基因组,对基因组进行克隆,将克隆条带处理后测序,鉴定各类微生物的种类,发掘更多的新物种,客观全面的揭示样品中微生物的多样性。在这类免培养的研究方法中提取到纯度较高的基因组是后续实验的基础。目前市场上的普通国产DNA提取试剂盒虽能得到质量较高的基因组DNA,但只是针对纯培养得到的微生物,对于直接从环境样品中提取微生物基因组DNA,用普通试剂盒效果较差,非微生物物质会堵塞DNA吸附柱,并且提取的DNA质量不稳定。手工提取样品基因组的方法效率较低,并且容易导致基因组的损失。直接利用普通试剂盒提取烟叶表面真菌的基因组DNA时,细小的烟叶碎片及尘土会堵塞DNA吸附柱,影响效率,甚至导致实验中断,烤烟烟叶浸泡后会有部分油性物质溢出,在遇到一些化合物时会形成粘性较大絮状物,这也会堵塞吸附柱。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术不足,提供一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法,从而实现高效方便提取大量烤烟烟叶表面真菌基因组DNA。本专利技术提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法,其特征在于该方法包括陈化烟叶表面真菌富集、使用液氮研磨处理真菌富集物和使用试剂盒提取样品基因组DNA的三个主要步骤,通过缓冲液浸泡和梯度离心让陈化烟叶表面真菌富集,经液氮研磨破壁处理真菌富集物,采用试剂盒提取真菌基因组DNA。提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的具体步骤如下:(1)陈化烟叶表面真菌的富集称取250g~300g的烟叶样品,剪碎,平均分装成4份,每份加入1000mL的pH7.0PBS缓冲液,充分震荡2~3小时;用双层纱布过滤收集浸泡液,将过滤液离心(10000×g,4℃)15~20min,弃上清;加入20ml无菌去离子水溶解沉淀,将其转移至50ml离心管中,再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL,涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min;加入0.5mol/LEDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol/L,涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min,离心(12000r/min,4℃)15~20min,弃上清,沉淀即为真菌富集物;(2)使用液氮研磨处理真菌富集物称取2~3g沉淀,置于预冷研钵中加液氮覆盖,用力充分研磨至粉末状;(3)使用试剂盒提取样品基因组采用DNAIsolationKit提取烟叶表面真菌总DNA,具体操作步骤如下:加入0.25g上述研磨后的粉末到一个PowerBeadTubes中,轻轻涡旋混匀,加入60μlSolutionC1,上下颠倒数次混匀;把PowerBeadTubes固定在涡旋仪适配器上,最大转速(3200r/min)涡旋连续振荡10min,室温10000×g离心30s;转移上清至一个干净的2mlCollectionTube中,加入250μlSolutionC2到上清中,涡旋混匀5s,4℃孵育5min,室温10000×g离心1min;避开沉淀小珠,转移上清≤600μl到一个新的收集管中,加入200μlSolutionC3到上清中,涡旋混匀,4℃孵育5min,室温10000×g离心1min;避开沉淀小珠,转移上清≤750μl到一个新的收集管中,加入1200μlSolutionC4到上清中,涡旋混匀5s,加载约675μl上清到SpinFilter中,室温10000×g离心1min,弃去滤液,继续加载675μl上清,室温10000×g离心1min,重复直至过滤完所有上清;加入500μlSolutionC5到SpinFilter中,室温10000×g离心30s,弃去上清,室温10000×g离心1min;小心转移Spinfilter(旋转过滤器)到2mlCollectionTube中,加入100μlSolutionC6到白色滤膜中心,室温10000×g离心30s,弃去SpinFilter;将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存,备用。本专利技术方法采用了液氮研磨与试剂盒提取相结合的方法,一方面用液氮研磨可充分裂解真菌细胞壁,提高真菌DNA提取效率,还可以避免烟叶碎末影响试剂盒离心柱膜的通透性的弊端,另一方面结合试剂盒提取可以有效提高基因组的获得率。本专利技术具有如下优点:液氮研磨的处理可有效裂解真菌细胞壁,提高真菌基因组DNA提取效率,还可以有效避免烟叶碎末影响试剂盒离心柱膜的通透性的弊端;试剂盒提取可以有效提高基因组的获得率,DNAIsolationKit包含了创新专利抑制因子去除(IRT),可用于提取所有类型环境样品高质量DNA,IRT(抑制因子去除技术)含有组分可沉淀那些会影响DNA纯度和下游实验的非DNA的有机、无机物质,如腐植酸、细胞碎片、蛋白质等,有效提高基因组的获得率,提取出来的高质量DNA可直接用于下游实验,无需进一步纯化。本专利技术方法针对烟叶样品的特殊性进行设计,避免烟叶碎沫等对实验的不良影响。此方法可以运用于全部的陈化烟叶表面真菌基因组的提取,具有应用范围广、提取效率高的特点。本专利技术方法提供的方法应用于云南省K326、红大等品种的陈化烤烟烟叶真菌基因组的提取,都达到良好的提取效果,提取的基因组均可用于各类分子学实验。附图说明图1是利用手提方法CTAB法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌18SrRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱;图2是利用手提方法尿素法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌18SrRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱;图3是经液氮研磨处理和试剂盒相结合的方法提取K326品种陈化中的烟叶表面真菌18SrRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术作进一步详细的描述,但本专利技术保护范围不局限于所述内容,实施例中所使用的方法如无特殊说明,均为常规方法;实施例中所使用的材料、试剂如无特殊说明,均可通过商业途径获得。本专利技术前期处理烟叶样品时,所本文档来自技高网
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一种<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201610792060.html" title="一种提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法原文来自X技术">提取陈化烟叶表面真菌基因组的方法</a>

【技术保护点】
一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法,其特征在于该方法包括陈化烟叶表面真菌富集、使用液氮研磨处理真菌富集物和使用试剂盒提取样品基因组DNA的三个主要步骤,通过缓冲液浸泡和梯度离心让陈化烟叶表面真菌富集,经液氮研磨破壁处理真菌富集物,采用试剂盒提取真菌基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法,其特征在于该方法包括陈化烟叶表面真菌富集、使用液氮研磨处理真菌富集物和使用试剂盒提取样品基因组DNA的三个主要步骤,通过缓冲液浸泡和梯度离心让陈化烟叶表面真菌富集,经液氮研磨破壁处理真菌富集物,采用试剂盒提取真菌基因组DNA。2.根据权利要求1所述的提取陈化烟叶表面真菌基因组DNA的方法,其特征在于具体步骤如下:(1)陈化烟叶表面真菌的富集称取250g~300g的烟叶样品,剪碎,平均分装成4份,每份加入1000mL的pH7.0PBS缓冲液,充分震荡2~3小时;用双层纱布过滤收集浸泡液,将过滤液离心(10000×g,4℃)15~20min,弃上清;加入20ml无菌去离子水溶解沉淀,将其转移至50ml离心管中,再加入DNaseⅠ至终浓度为1u/mL,涡旋震荡混匀后于37℃恒温水浴30min;加入0.5mol/LEDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol/L,涡旋震荡混匀后于65℃恒温水浴10min,离心(12000r/min,4℃)15~20min,弃上清,沉淀即为真菌富集物;(2)使用液氮研磨处理真菌富集物称取2~3g沉淀,置于预冷研钵中加液氮覆盖,用力充分研磨至粉末状;(3)使用试剂盒提取样品基因组采用DNAIsolationKit试剂盒提取烟叶表面真菌总DNA,具体操作步骤如下:加入0.25g上述研磨后的粉末到一个PowerBe...

【专利技术属性】
技术研发人员:王毅高锐宋鹏飞张光煦杨威李欣亚李海燕魏云林浦绍占季秀玲
申请(专利权)人:云南中烟工业有限责任公司
类型:发明
国别省市:云南;53

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