高透皮吸收皮下靶向释放型因子及构建方法和应用技术

本发明专利技术为涉及一种高透皮吸收皮下靶向释放型人表皮生长因子及构建方法和应用，依照表达宿主的密码子偏爱性，优化并将hEGF、细胞穿膜肽、皮下内源性蛋白酶酶切位点三部分基因片段拼接在一起，连接到表达质粒中构建获得高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF的表达载体，转化到大肠杆菌等宿主中以实现高效表达生产。本发明专利技术方法克服了hEGF作为生物大分子物质所具有的透皮性低的缺陷，使hEGF可以高效跨越皮肤角质层，并在皮下靶向释放发挥促进成纤维细胞增殖等作用，从而显著提高其在护肤、除痘、祛皱、美白等方面的实际功效，为相关美容产品和生物药物的开发生产提供了一种新视角与新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药及化妆品领域，尤其是一种高效透皮吸收皮下靶向释放的hEGF的设计和美容应用。
技术介绍
表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）是一种含有53个氨基酸的单链多肽，不仅作用于表皮细胞，还作用于皮纤维细胞、角化细胞等，自动与其细胞膜上EGF受体（EGF-R）结合，具有极强地促进细胞增殖的能力，故可作为化妆品添加剂及药物发挥皮肤修复、调养及去痘（去除粉刺、痊疮和青春痘）、美白等功效。然而，作为一种生物大分子，透皮吸收差一直是困扰其实际应用的重大问题。细胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides，CPP）是一种能够携带蛋白质等多种外源性物质进入细胞的小分子多肽，实现物质细胞内化，高效透皮性。为获得一种高透皮性、皮下靶向释放的hEGF，本课题利用基因工程的方法在EGF的N端引入细胞穿膜肽，并在二者间添加了皮下高表达的蛋白酶酶切位点以实现其皮下释放及发挥作用的靶向性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服生物大分子物质低透皮性的缺陷，设计一种高透皮、皮下靶向释放型hEGF因子及重组工程菌的构建表达，本专利技术获得的重组蛋白使hEGF在细胞穿膜肽的携带下顺利穿过皮肤角质层细胞，并在皮下靶向定位于成纤维细胞促进细胞的增值，提高了其透皮率和靶向性，为生物美容产品和生物药物的生产提供了一种新视角与新方法。本专利技术实现目的的技术方案如下：本专利技术通过分子生物学方法在hEGF的N端引入细胞穿膜肽—例如（但不限于）Pep-1、TAT、MPG、多聚精氨酸等，以MMP-2、MMP-9等皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点作为二者的连接臂，将三者拼接在一起。将三者拼接后的基因（PME）插入到基因工程表达载体的多克隆位点，构建得到PME表达质粒。将PME表达质粒转化至宿主—例如（但不限于）大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、真核哺乳动物细胞等，筛选构建得到高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF因子工程表达系统，表达、分离、纯化获得高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF因子。具体方法如下：一种高透皮吸收皮下靶向释放型因子，细胞穿膜肽与hEGF因子用连接臂连接，连接臂为皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点短肽。而且，所述细胞穿膜肽为可携带生物活性物质进入细胞的肽类物质。而且，所述细胞穿膜肽为Pep-1、TAT、MPG或多聚精氨酸。而且，所述皮下内源性表达的蛋白酶为在皮下具有内源性表达及活性、具有特定酶切识别位点的蛋白酶，包括基质金属蛋白酶MMP-2、基质金属蛋白酶MMP-9、胶原酶、明胶酶、溶基质素、角蛋白酶、组织蛋白酶。高透皮吸收皮下靶向释放型因子的构建方法，步骤如下⑴将hEGF基因的N端引入细胞穿膜肽基因，以皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点作为二者的连接臂，将三者拼接在一起；⑵将三者拼接后的基因插入到基因工程表达载体的多克隆位点，构建得到表达质粒；⑶将表达质粒转化至宿主，筛选构建得到高透皮吸收皮下靶向释放型因子的基因工程表达系统。而且，所述宿主及其表达质粒为大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统、乳酸菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统的宿主及其表达质粒。而且，所述细胞穿膜肽为可携带生物活性物质进入细胞的肽类物质。而且，所述细胞穿膜肽为Pep-1、TAT、MPG或多聚精氨酸。一种高透皮吸收皮下靶向释放型因子作为美容制剂应用。一种高透皮吸收皮下靶向释放型因子作为制备治疗皮肤类疾病生物制剂的应用。本专利技术的有益效果和优点是：1、本专利技术成功的设计了一种高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF，具有很好的跨膜转运及透皮吸收的能力，同时在皮下可被皮下蛋白酶切割去除细胞穿膜肽、实现靶向有效释放，促进皮下成纤维细胞的增殖、迁移，从而发挥祛皱等美容功效。2、本专利技术建立了这种高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF的基因工程表达方法，为其产业化奠定了基础。3、本专利技术所获得的重组蛋白PME不仅使hEGF因子克服了生物大分子物质低透皮性的缺陷，还使其靶向作用于皮下成纤维细胞，促进细胞增殖以发挥其护肤、除痘、祛皱、美白等功效，为生物美容产品和生物药物的生产提供了一种新视角与新方法。附图说明图1为本专利技术重组质粒（以大肠杆菌表达质粒pET22b-PME为例）双酶切验证图，泳道1是pET22b空载质粒被NcoI和XhoI双酶切结果，泳道2是重组质粒pET22b-PME为被NcoI和XhoI双酶切结果，泳道3是PME基因PCR产物。图2为包涵体蛋白的Ni亲和层析纯化，（图2a）泳道1、2、3分别是利用1、2、3M尿素洗涤蛋白，（图2b）泳道1为未纯化的蛋白，泳道2为流穿液，泳道3、4、5、6分别为利用10mM、50mM、100mM、300mM咪唑洗脱的蛋白。图3为目的蛋白的westernblot检测，泳道1为PME蛋白检测结果。图4为重组蛋白的生物学活性检测。图5为蛋白跨越角质细胞膜转运能力分析。图6为MMP-2金属基质蛋白酶酶切融合蛋白。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术设计一种高透皮吸收皮下靶向释放型的重组蛋白，并建立其基因工程表达方法，具体内容包括：⑴通过分子生物学方法在hEGF基因的N端引入细胞穿膜肽，以皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点作为二者的连接臂，将三者拼接在一起。所述细胞穿膜肽为一类可以携带多种不同大小和性质的生物活性物质（蛋白质、核酸、多糖等）进入细胞的肽类物质，包括（但不限于）Pep-1、TAT、MPG、多聚精氨酸等。所述皮下内源性表达的蛋白酶为在皮下具有内源性表达及活性、具有特定酶切识别位点的蛋白酶，包括（但不限于）基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9等）、胶原酶、明胶酶、溶基质素、角蛋白酶、组织蛋白酶等。⑵将三者拼接后的基因（PME）插入到基因工程表达载体的多克隆位点，构建得到PME表达质粒。⑶将PME表达质粒转化至宿主细胞中，筛选构建得到高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF因子的工程表达系统，表达、分离、纯化获得高透皮吸收、皮下靶向释放型hEGF因子（蛋白）。所述基因工程表达宿主及其表达质粒为各种可实现外源基因转入、复制、转录、翻译表达产生蛋白质产物的宿主及其对应表达质粒系统，包括（但不限于）大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统、乳酸菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统等。一、PME基因的构建方法，步骤如下：以下表中引物进行重叠PCR扩增在引物P1、P4中分别引入NcoI和XhoI酶切位点，下划线部分。重叠PCR分为三步：第一、二步，以人cDNA及合成的细胞穿膜肽基因为模板，利用引物P1和P2，引物P3和P4分别扩增出细胞穿膜肽（此处以pep-1为例）、EGF两段基因；第三步，以前两步获得的PCR产物为模板，以P1和P4为引物进行PCR扩增得到目的基因PME。具体体系及扩增条件如下：扩增PME的PCR反应体系循环参数：94℃预变性5min，72℃末端延伸10min二、PME的基因工程诱导表达（以大肠杆菌表达系统为例）1、将PME基因插入到表达载体（以pET22b为例）的多克隆位点，构建得到PME重组质粒。将PME基因和pET22b质粒用NcoI和XhoI双酶切后，经T4DNA连接酶16℃水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高透皮吸收皮下靶向释放型因子，其特征在于：细胞穿膜肽与hEGF因子用连接臂连接，连接臂为皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点短肽。

【技术特征摘要】
1.一种高透皮吸收皮下靶向释放型因子，其特征在于：细胞穿膜肽与hEGF因子用连接臂连接，连接臂为皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点短肽。2.根据权利要求1所述的高透皮吸收皮下靶向释放型因子，其特征在于：所述细胞穿膜肽为可携带生物活性物质进入细胞的肽类物质。3.根据权利要求1或2所述的高透皮吸收皮下靶向释放型因子，其特征在于：所述细胞穿膜肽为Pep-1、TAT、MPG或多聚精氨酸。4.根据权利要求1所述的高透皮吸收皮下靶向释放型因子，其特征在于：所述皮下内源性表达的蛋白酶为在皮下具有内源性表达及活性、具有特定酶切识别位点的蛋白酶，包括基质金属蛋白酶MMP-2、基质金属蛋白酶MMP-9、胶原酶、明胶酶、溶基质素、角蛋白酶、组织蛋白酶。5.高透皮吸收皮下靶向释放型因子的构建方法，其特征在于：步骤如下⑴将hEGF基因的N端引入细胞穿膜肽基因，以皮下内源性表达的蛋白酶酶切位点作为二者的连接臂，将三者拼接在一...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学刚，王玥，闫莉华，张同存，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12