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一种DNA甲基化实时检测方法及其应用技术

技术编号:15040036 阅读:447 留言:0更新日期:2017-04-05 13:26
本发明专利技术公开了一种DNA甲基化实时检测方法及其应用。本发明专利技术基于DNA双链的长程电子转移特性,结合特异性化学衍生化反应,建立一种快速、简便的DNA甲基化动态过程实时电化学检测方法和电化学生物传感器,并应用于DNA甲基化过程的实时检测,酶抑制剂筛选,以及酶序列偏好性等研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于电化学检测
,具体涉及一种基于溴原子稀释DNA长程电子转移原理的DNA甲基化实时检测方法及其应用
技术介绍
DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶(MTases)作用下,催化底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM),转移一个甲基至胞嘧啶的C5位置,生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。作为重要的表观遗传学修饰方式之一,DNA甲基化与胚胎发育、染色体结构、基因印记等密切相关。DNA甲基化是一个动态过程,异常的MTases表达通常引起异常甲基化修饰,并与人类各种疾病相关。因此,深入理解DNA甲基化过程及MTases功能在疾病诊断、药物筛选、细胞重编程、全能细胞研究等方面具有重要意义。DNA甲基化研究方法分为基因组整体甲基化水平分析,特异位点甲基化分析,以及新甲基化位点寻找等。常规分析方法有甲基化特异性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物扩增(MS-SNuPE)、重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、限制性标记基因组扫描(RLGS)、甲基化免疫沉淀(MIP)等。这些方法通常基于甲基化位点识别与信号放大。首先通过化学或生物方法区分DNA链中甲基化的胞嘧啶(mC)和非甲基化胞嘧啶(C),进一步利用凝胶电泳、荧光光谱、质谱、基因测序或电化学等技术检测甲基化的DNA。虽然这些方法已被广泛应用于临床和基础研究,但多数方法操作繁琐、耗时长、检测成本高或依赖复杂设备如分光光度计或荧光仪等。更重要的,这些方法只能提供静态的甲基化状态的“快照”。实现动态甲基化过程的实时检测,对于更加深入理解甲基化过程的机制,更加精确的研究甲基化转移酶活性、酶抑制剂、酶序列偏好性等基本问题,具有重要的意义。当前,尚无实时检测动态甲基化过程的有效方法,该难题仍然是甲基化研究面临的瓶颈问题之一。实现跟踪动态DNA甲基化过程面临两个难点:(1)难以捕捉该修饰过程的微小变化。由于甲基是个很小的基团,常规的实时分析技术,如石英晶体微天平(QCM)或表面等离子体共振技术(SPR)难于在没有经过信号放大的情况下检测这一修饰过程。质谱技术可能有足够的灵敏度,但质谱分析通常是以离线的方式进行。(2)难于实现信号的同步放大。DNA甲基化需要高灵敏度的分析方法,因此通常依赖于多种信号放大策略,如聚合酶链反应(PCR)或生物亲和技术。PCR方法需要通过亚硫酸氢盐或限制性内切酶预处理待测DNA链。生物亲和策略通常使用mCpG抗体或甲基化位点结合蛋白(MBD)与甲基化位点结合,增加DNA甲基化后的信号变化。然而,该信号变化来源于DNA的甲基化修饰和生物亲和分子与甲基化位点结合的总反应过程,其主要反映的是决速步骤(反应速度最慢的步骤)的反应过程。
技术实现思路
本专利技术基于DNA双链的长程电子转移特性,结合特异性化学衍生化反应,建立一种快速、简便的DNA甲基化动态过程实时电化学检测方法和电化学生物传感器,并应用于DNA甲基化过程的实时检测,酶抑制剂筛选,以及酶序列偏好性等研究。本专利技术所采取的技术方案是:一种电化学生物传感器,其包括电极,电极表面修饰有待测DNA双链,所述待测DNA双链含有甲基化位点,并标记有电活性物质。电活性物质是指在电场作用下能发生氧化还原反应的物质,其在本专利技术技术方案中所起的作用是产生可被检测的电化学信号,以便后续的实验结果分析。电化学检测中,常用的电活性标记物包括二茂铁,铁氰化钾,亚甲基蓝,均可用于本专利技术的技术方案中。所述电活性物质修饰在纳米载体上,再通过纳米载体固定到待测DNA双链上。纳米载体在此处所起的作用是:承载电活性物质(如二茂铁等),提高电活性物质的修饰量,增大电化学反应信号,改善测试灵敏度。因此,所述纳米载体具有导电性,粒径≤25nm,例如金纳米粒子。所述电极为惰性金属电极或玻碳电极,包括金电极、银电极、铂电极或玻碳电极,均可用于本专利技术的技术方案中。作为优选的,电活性物质可通过共价结合(例如金-硫共价结合)原理、亲和系统(例如生物素-亲和素系统,抗体-抗原亲和系统)、或先构建功能化导电聚合物膜的方法固定到纳米载体上;作为优选的,负载电活性物质的纳米载体通过共价结合(例如金-硫共价结合)原理、亲和系统(例如生物素-亲和素系统,抗体-抗原亲和系统)、或先构建功能化导电聚合物膜的方法固定到待测DNA双链上;作为优选的,待检DNA双链通过共价结合(例如金-硫共价结合)原理、亲和系统(例如生物素-亲和素系统,抗体-抗原亲和系统)、或先构建功能化导电聚合物膜的方法固定到电极上。一种DNA甲基化实时检测试剂盒,其包括以上所述的电化学生物传感器,以及甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸、溴原子供体、强氧化剂。作为优选的,所述强氧化剂包括高碘酸钠、重铬酸钾、高锰酸钾中的至少一种,强氧化剂在此处的作用是通过特异性氧化反应,在甲基胞嘧啶的C4位置上键合一个溴原子;所述溴原子供体为溴化物,例如溴化锂。一种DNA甲基化实时检测方法,包括如下步骤:(1)制备电化学生物传感器;(2)对电化学生物传感器上修饰的待检DNA双链进行从头甲基化反应;(3)对步骤(2)甲基化反应生成的5-mC进行特异性化学衍生化反应,使其DNA双链的电子转移效率明显下降,产生电化学信号差异;(4)实时监测该电化学信号的变化,以跟踪DNA动态甲基化过程。步骤(3)所述特异性化学衍生化反应为溴衍生化反应,在溴原子和强氧化剂存在的情况下发生。该技术方案的具体原理如下:已知双螺旋DNA由于其磷酸骨架和碱基间的π电子云堆积,具有长程电子转移能力。该长程电子转移的效率依赖于DNA双链中的C:G碱基对,并极大地受C:G碱基对间π电子云堆积情况变化影响,如碱基修饰或错配、DNA熔链、大分子的结合或吸附等。由于DNA甲基化过程不仅是一个特定的碱基修饰过程,而且也可作为特异性化学反应的活性位点,本方法利用甲基化过程对DNA双链的长程电子传递特性的影响,结合特异性的溴衍生化反应进一步增加该影响,建立简便的DNA甲基化实时动态电化学检测方法。其具体步骤如图1所示:制备电化学生物传感器,传感器表面修饰含有甲基化位点的、标记有电活性物质的DNA双链,形成电子传递通路。在MTases/SAM存在下,待分析位点发生甲基化后,生成的5-mC迅速发生特异性溴衍生化反应,在甲基胞嘧啶的C4位置上键合一个溴原子,在溴原子和甲基基团的共同作用下,引起DNA双链的电子转移效率明显下降,产生电化学信号差异,高斯计算证实了该长程电子传递能力的降低来源于溴对所在区域的π电子云分布的影响。通过实时监测该电化学信号的变化,可跟踪DNA动态甲基化过程。本专利技术的有益效果是:该方法通过溴原子供体和强氧化剂对甲基化胞嘧啶的特异性氧化反应,在甲基胞嘧啶的C4位置上键合一个溴原子,在溴原子和甲基基团的共同作用下,双链DNA的长程电子传递能力明显降低,所产生的电化学信号明显减弱,且所减弱的电化学信号与目标碱基的甲基化程度成正比。该方法具有快速,灵敏,不受溶液浊度影响,操作方便,使用成本低,易于微型化和实现现场检测等特点,在DNA甲基化检测方面具有独特优势:(1)衍生化反应速率快,可与DNA甲基化过程同步,实现了检测的即时性,适用于临床上在线快速检测;(2)检测过程中无需二次标记或二次反应,简本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种电化学生物传感器,其包括电极,电极表面修饰有待测DNA双链;所述待测DNA双链含有甲基化位点,并标记有电活性物质。

【技术特征摘要】
1.一种电化学生物传感器,其包括电极,电极表面修饰有待测DNA双链;所述待测DNA双链含有甲基化位点,并标记有电活性物质。2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器,其特征在于,所述电活性物质为二茂铁、铁氰化钾、亚甲基蓝中的任一种。3.根据权利要求2所述的电化学生物传感器,其特征在于,所述电活性物质通过纳米载体固定到待测DNA双链上;所述纳米载体具有导电性,粒径≤25nm。4.根据权利要求1-3任一项所述的电化学生物传感器,其特征在于,所述电极包括金电极、银电极、铂电极或玻碳电极。5.根据权利要求1-3任一项所述的电化学生物传感器,其特征在于,电活性物质通过共价结合、亲和系统、或先构建功能化导电聚合物膜的方法固定到纳米载体上;负载电活性物质的纳米载体通过共价结合、亲和系统、或先构建功能化导电聚合物膜的方法固定到待测DNA双链上;待检DNA双链通过共价结合、亲和系统、或先构建功能化导电聚合物膜的方法固定到电极上。6.一种DNA甲基化实时...

【专利技术属性】
技术研发人员:戴宗张立邹小勇
申请(专利权)人:中山大学
类型:发明
国别省市:广东;44

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