本发明专利技术涉及电化学免疫传感器技术领域，特别是涉及一种基于富勒烯（C60）本身特性为发光材料和基底材料的前列腺特异性抗原（PSA）的电致化学发光免疫传感器的构建方法。以C60为发光材料扩展了C60的应用范围，并且C60是电子传递良好的媒介体，以C60作为基底材料能够很好的促进电子传递，使构建的免疫传感器具有检出限低，线性范围宽，稳定性、选择性和重现性好等一系列优良的性能，为快速、灵敏检测前列腺特异性抗原（PSA）提供了一种新的路径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及快速、灵敏检测前列腺特异性抗原（PSA）的免疫传感器
，特别是涉及一种基于富勒烯（C60）本身特性为发光材料和基底材料的电致化学发光免疫传感器的构建方法。构建的免疫传感器具有检出限低，线性范围宽，稳定性、选择性和重现性好等一系列优良的性能，为快速、灵敏检测PSA提供了一种新的路径。
技术介绍
肿瘤标志物指在恶性肿瘤的增殖过程中，由于相关肿瘤细胞的基因表达或机体对肿瘤发生反应而异常变化的物质。肿瘤标志物在肿瘤早期诊断、预防、药效评价和预后诊断方面发挥着极为重要的作用。目前肿瘤标志物存在的主要缺陷是：特异性和灵敏度不够高，存在漏诊或误诊的可能；检测费用偏高，在普通查体中难以普及。未来肿瘤标志物的发展方向是开发高特异性、高灵敏度、方便和快捷的检测方法，能够针对各种肿瘤达到极高的早期诊断率并对各种药物的药效和预后具有准确且有效的评价。目前肿瘤标志物的筛选手段主要有三大类：免疫学方法、分子生物学方法和生物化学方法。免疫学方法在临床中应用较普遍，主要包括酶联免疫测定、放射免疫测定和免疫荧光测定。随着新技术的发展，生物芯片、荧光原位杂交、双向电泳、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱、表面增强激光解析飞行时间质谱等技术也在不断的涌现。找到针对某种肿瘤肿瘤标志物灵敏度和特异性的检测手段，然后建立一种快速、高效、灵敏的检测方法尤为重要。C60的高对称性结构使其导带和价带之间的跃迁被严格的禁止，当对C60施加一定的电场强度时，C60发生极化，分子构型被破坏，导带和价带之间的跃迁得以实现，使C60具有发光性能。本专利技术以L-cys/C60复合物制备电致发光电极，构建电致化学发光免疫传感器，扩展了C60的应用范围。使构建的免疫传感器具有检出限低，线性范围宽，稳定性、选择性和重现性好等一系列优良的性能，为快速、灵敏检测前列腺特异性抗原（PSA）提供了一种新的路径。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述肿瘤标志物测定中的缺点而提供一种以富勒烯本身特性为发光材料和基底材料构建电致化学发光免疫传感器的方法，并将其用于对前列腺特异性抗原（PSA）快速、灵敏的检测。本专利技术的技术方案为：一种富勒烯（C60）电致化学发光电极，该电极是以半胱氨酸（L-cys）-C60复合物作为发光材料制备并以此构建免疫传感器用于电致化学发光高灵敏检测前列腺特异性抗原（PSA）。富勒烯（C60）电致化学发光电极，具体制作步骤为，将玻碳电极在麂皮上依次用0.3、0.05μmAl2O3粉抛光成镜面，然后用超纯水冲洗掉表面的Al2O3，并依次在乙醇和超纯水中各超声10s，室温下晾干；将L-cys-C60复合物超声分散均匀，用移液枪移取10μL的L-cys-C60复合物滴涂于电极表面，常温下晾干。利用上述电极富勒烯电致化学发光电极制备免疫传感器的方法，具体步骤为：取10μL2.5%的戊二醛水溶液滴涂在L-cys-C60/GCE表面并于4℃孵育2h，用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的戊二醛；将20μL10μg/mL的T-PSA滴涂于戊二醛修饰的电极表面，4℃孵育12h并用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的T-PSA得到T-PSA/L-cys-C60/GCE；取20μLpH为7.4的0.2%BSA的混合溶液滴涂于上述T-PSA/L-cys-C60/GCE表面，在37℃孵育1h以封闭非特异性结合位点，然后用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的BSA。将一定浓度的PSA抗原20μL滴涂到以BSA封闭非特异性结合位点的BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE表面，在37℃下孵化1h后，用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的PSA，得到PSA/BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE。利用上述免疫传感器测定PSA的方法，具体骤如下：①以PSA/BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；使用MPI-B型多参数化学发光分析测试系统，其附属的计算机软件供作实验数据的采集和处理。光电倍增管的高压设置为800V，扫描区间为-2.5~0V，扫描速度为100mV/s；②在10mL含有0.1mol/L过硫酸钾的PBS(pH7.4)缓冲溶液的电解池中，通过MPI-B型多参数化学发光分析测试系统检测未特异性结合PSA的电极的电致化学发光强度（I0）以及特异性结合不同浓度的PSA的电极的电致化学发光强度（I），计算两者峰值差ΔI（ΔI=I0-I）。ΔI与前列腺特异性抗原浓度的对数lgc呈现良好的线性关系，线性范围为0.001~50ng/mL，其线性方程为ΔI=1614lgc+7541，c浓度，单位是ng/mL，线性相关系数为R=0.99422，检出限为0.5pg/mL；③结合上述线性方程，对未知浓度的PSA溶液样品进行测定，计算出PSA的浓度；在10mL含有0.1mol/L过硫酸钾的PBS(pH7.4)缓冲溶液的电解池中，以PSA/BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；使用MPI-B型多参数化学发光分析测试系统，其附属的计算机软件供作实验数据的采集和处理。光电倍增管的高压设置为800V，扫描区间为-2.5~0V，扫描速度为100mV/s；通过MPI-B型多参数化学发光分析测试系统检测未特异性结合PSA的电极的电致化学发光强度（I0）以及特异性结合未知浓度的PSA的电极的电致化学发光强度（I）。将测得的峰值差ΔI（ΔI=I0-I）代入上述所得的线性方程中，计算未知溶液样品中PSA的浓度。本专利技术的有益效果为：本专利技术以富勒烯（C60）为发光材料构建免疫传感器，扩展了富勒烯的应用范围；以L-cys-C60复合物为基底材料，利用富勒烯良好的生物相容性、表面反应活性和优异的吸附能力，可大量固定抗体，放大信号；制备的免疫传感器用于PSA的检测，操作简单，检出限低，线性范围宽，灵敏度高。线性范围为0.001~50ng/mL，检出限为0.5pg/mL。附图说明：图1所示为不同电极电致化学发光图谱；其中，1—裸玻碳电极（GCE），2—C60/GCE，3—L-cys-C60/GCE，4—BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE，5—PSA/BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE图2所示为PSA浓度变化时电致化学发光图谱；其中，1-0ng/mL，2-.001ng/mL，3-0.005ng/mL，4-0.01ng/mL，5-0.05ng/mL，6-0.1ng/mL，7-0.5ng/mL，8-1ng/mL，9-5ng/mL，10-10ng/mL，11-50ng/mL具体实施方式：为了更好地理解本专利技术，下面用具体实例来详细说明本专利技术的技术方案，但是本专利技术并不局限于此。实施例1L-cys-C60复合物的制备：0.0054gC60溶解在5mL甲苯溶液中，超声使之完全溶解；移取1mL上述C60溶液，加入到半胱氨酸L-半胱氨酸NaOH溶液中,搅拌混合。离心分离得到黑褐色的L-cys-C60复合物，将其分散在2mL的二次水中。实施例2富勒烯（本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种富勒烯（C60）电致化学发光电极，其特征在于，该电极是以半胱氨酸（L‑cys）‑C60复合物作为发光材料制备并以此构建免疫传感器用于电致化学发光高灵敏检测前列腺特异性抗原（PSA）。
【技术特征摘要】
1.一种富勒烯（C60）电致化学发光电极，其特征在于，该电极是以半胱氨酸（L-cys）-C60复合物作为发光材料制备并以此构建免疫传感器用于电致化学发光高灵敏检测前列腺特异性抗原（PSA）。2.根据权利要求1所述的一种富勒烯（C60）电致化学发光电极，其特征在于，具体制作步骤为，将玻碳电极在麂皮上依次用0.3、0.05μmAl2O3粉抛光成镜面，然后用超纯水冲洗掉表面的Al2O3，并依次在乙醇和超纯水中各超声10s，室温下晾干；将L-cys-C60复合物超声分散均匀，用移液枪移取10μL的L-cys-C60复合物滴涂于电极表面，常温下晾干。3.根据权利要求1所述的一种富勒烯（C60）电致化学发光电极制备免疫传感器的方法，其特征在于，具体步骤为：取10μL2.5%的戊二醛水溶液滴涂在L-cys-C60/GCE表面并于4℃孵育2h，用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的戊二醛；将20μL10μg/mL的T-PSA滴涂于戊二醛修饰的电极表面，4℃孵育12h并用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的T-PSA得到T-PSA/L-cys-C60/GCE；取20μLpH为7.4的0.2%BSA的混合溶液滴涂于上述T-PSA/L-cys-C60/GCE表面，在37℃孵育1h以封闭非特异性结合位点，然后用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的BSA；将一定浓度的PSA抗原20μL滴涂到以BSA封闭非特异性结合位点的BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE表面，在37℃下孵化1h后，用pH为7.4的磷酸缓冲溶液冲洗未键合的PSA，得到PSA/BSA/T-PSA/L-cys-C60/GCE。4.根据权利要求3所述的免疫传感器...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈培培，周长利，许馨元，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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