一种海洋生物肽Xen2174的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种Xen2174肽的合成方法，先固相合成线性肽，然后定向形成两对二硫键，即通过固相氧化形成第一对二硫键(即4-13二硫键)，通过液相辣根过氧化物酶氧化形成第二对二硫键(即5-10二硫键)，粗肽经纯化得到Xen2174精肽。该方法具有操作简单、工艺简化、合成条件温和、环境友好、经济效益高、可规模化生产等优点。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及多肽合成
，具体而言涉及一种海洋生物肽Xen2174的合成方法。
技术介绍
Xen2174肽是一种由13个氨基酸组成且含有两对二硫键的多肽，肽序如下：pGlu-Gly-Val-Cys-Cys-Gly-Tyr-Lys-Leu-Cys-His-4Hyp-Cys-NH2，二硫键连接方式为4-13和5-10，分子量为1404.68。Xen2174肽属于χ-芋螺毒素，是由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)分泌的生物活性肽类毒性物质，这类生物活性肽被统称为芋螺毒素(conotoxin或conopeptide)。Xen2174肽是高选择性的去甲肾上腺素转运体(NET)抑制剂，其在动物疼痛模型上具有高的治疗指数，并且没有观察到副作用。Xen2174肽已被澳大利亚Xenome公司开发成药物并已进入II期临床试验，该药物通过鞘内注射来减轻神经性疼痛。到目前为止，只有专利文献US20090088389A1和非专利文献(Chem.Commun.，2014，50，8408-8411)公开了两种制备Xen2174肽的方法.第一种方法(见图1)：使用氨基树脂，通过标准的Fmoc固相肽合成制备线性肽，然后在液相中通过DMSO氧化形成两对二硫键(4-13，5-10)，采用反相高效液相色谱法纯化得到Xen2174精肽。此方法的缺点在于不能定向氧化形成两对二硫键，存在二硫键的错配杂质，产率较低.第二种方法(见图2)：使用氨基树脂，通过标准的Fmoc固相肽合成制备肽树脂，裂解得到线性肽后，在液相中先氧化形成第一对二硫键4-13，然后通过碘氧化形成第二对二硫键5-10。粗肽经反相高效液相色谱法纯化得到Xen2174精肽。此方法的缺点在于通过碘氧化形成第二对二硫键时，很容易将此肽中7号位的Tyr碘代，导致杂质增多，同时过量的碘很难除掉。产率很低。本专利技术提供一种Xen2174肽的合成方法，先固相合成线性肽，然后定向形成两对二硫键，即通过固相氧化形成第一对二硫键(即4-13二硫键)，通过液相辣根过氧化物酶氧化形成第二对二硫键(即5-10二硫键)，粗肽经纯化得到Xen2174精肽。该方法具有操作简单、工艺简化、合成条件温和、环境友好、经济效益高、可规模化生产等优点。
技术实现思路
本专利技术提供一种止痛药物Xen2174肽的合成方法，其包括以下步骤：步骤(1)：按照Fmoc固相合成方法，在树脂上依次偶联各Fmoc-AA-OH；步骤(2)：固相脱除肽链第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基；步骤(3)：通过固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键；步骤(4)：脱除树脂，第5位和第10位半胱氨酸残基上的保护基同时被脱除；步骤(5)：通过液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键；以及任选的步骤(6)：纯化。步骤(1)中所使用的树脂为氨基树脂，可选自RinkAmide-AM树脂、MBHA树脂、PAL树脂等。优选地，树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.2-0.5mmol/g，最优选0.303mmol/g.优选地，在进行偶联反应之前，对树脂进行洗涤和溶胀处理，所用溶剂选自DMF、NMP和DCM，优选DMF。步骤(1)中按照Xen2174肽的氨基酸顺序，从C-端开始依次偶联Fmoc-AA-OH形式的各个氨基酸.其中对于第13位和第4位的半胱氨酸残基，使用Fmoc-Cys(Mmt)-OH；而对于第10位和第5位的半胱氨酸残基，使用Fmoc-Cys(Dpm)-OH。对于其他氨基酸的Fmoc-AA-OH形式没有特别限定，可以依照本领域的常规知识使用或者不使用保护基，可使用的保护基例如，Trt、Boc和tBu等。作为优选，可使用以下Fmoc-AA-OH形式的氨基酸，如Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH等.更优选地，所述依次偶联的各Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-4Hyp(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-pGlu-OH。步骤(1)中所述Fmoc固相合成方法包括以下步骤：1)脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；2)将合适量的Fmoc-AA-OH形式的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到偶联反应终止为止；以及3)重复步骤1)和2)直至偶联上所有的氨基酸。其中脱除Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶与DMF体积比为1∶4的混合溶液。步骤(1)中所使用的偶联剂为DIC与化合物A的混合物或DIA与化合物A和化合物B的混合物，优选DIC与化合物A的混合物.其中化合物A选自HOBt和HOAt，化合物B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU.进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIC：化合物A＝1.2∶1.1，DIA∶化合物A∶化合物B＝2.0∶1.1∶1.0。步骤(1)的偶联反应在固相反应柱中进行.对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任何固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在-10℃至60℃范围内进行。在没有特别说明的情况下，本专利技术的各反应在室温和常压下进行.步骤(1)的偶联反应中所应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任何方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮。当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的氨基，即氨基上无保护基.当所使用的第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基为Mmt，步骤(2)中所使用的脱除Mmt保护基的试剂为1％-5％的TFA/CH2Cl2溶液，优选2％TFA/CH2Cl2溶液.步骤(3)所使用的氧化剂选自H2O2和NCS，优选NCS。步骤(4)可采用裂解液脱除树脂，所述裂解液为TFA、H2O、PhOMe和苯甲硫醚的混合物.优选地，TFA、H2O、PhOMe和苯甲硫醚的体积比为75～95∶20～4∶4～0.1∶1～0.1，更优选为80～90∶15～4∶3～0.1∶1～0.1，最优选90∶5∶4∶1、85∶5∶9∶1或85∶10∶4∶1。步骤(5)所使用的氧化剂为辣根过氧化酶，辣根过氧化酶的用量为步骤(4)所得环肽重量的0.5％-10％，更优选1.5％-2.5％，最优选1.8％或2.0％。步骤(6)所述纯化可采用本领域常规的纯化方法进行，例如色谱法进行。优选的色谱法如反相色谱法，特别是反相高效液相色谱法，即RP-HPLC.进一步地，所述反相高效液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相等梯度洗脱，流动相比例优选为98∶2至50∶50，更优选80本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Xen2174肽的合成方法，包括以下步骤：步骤(1)：按照Fmoc固相合成方法，在树脂上依次偶联各Fmoc‑AA‑OH；步骤(2)：固相脱除肽链第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基；步骤(3)：通过固相氧化形成第一对二硫键，即4‑13二硫键；步骤(4)：脱除树脂，第5位和第10位半胱氨酸残基上的保护基同时被脱除；优选采用裂解液进行，所述裂解液优选为三氟乙酸、水、苯甲醚和苯甲硫醚的混合物；以及步骤(5)：通过液相氧化形成第二对二硫键，即5‑10二硫键。

【技术特征摘要】
1.一种Xen2174肽的合成方法，包括以下步骤：步骤(1)：按照Fmoc固相合成方法，在树脂上依次偶联各Fmoc-AA-OH；步骤(2)：固相脱除肽链第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基；步骤(3)：通过固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键；步骤(4)：脱除树脂，第5位和第10位半胱氨酸残基上的保护基同时被脱除；优选采用裂解液进行，所述裂解液优选为三氟乙酸、水、苯甲醚和苯甲硫醚的混合物；以及步骤(5)：通过液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键。2.权利要求1的方法，其中步骤(1)中所使用的树脂为氨基树脂，如RinkAmide-AM树脂MBHA树脂和PAL树脂；优选地，树脂的替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.2-0.5mmol/g，最优选0.303mmol/g；优选地，在进行偶联反应之前，对树脂进行洗涤和溶胀处理；所用溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷，优选N，N-二甲基甲酰胺。3.权利要求1或2的方法，其中步骤(1)：按照Xen2174肽的氨基酸顺序，从C-端开始依次偶联Fmoc-AA-OH形式的各个氨基酸；优选地，其中对肽链第13位和第4位的半胱氨酸残基，使用Fmoc-Cys(Mmt)-OH；对肽链第5位和第10位的半胱氨酸残基，使用Fmoc-Cys(Dpm)-OH；对肽链其他位置的氨基酸使用或不使用保护基，当使用保护基时，所使用的保护基选自Trt、Boc和tBu；更优选地，所述依次偶联的各Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-4Hyp(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、
\tFmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-pGlu-OH。4.权利要求1或2的方法，其中步骤(1)中所述Fmoc固相合成方法包括以下步骤：1)脱除Fmoc；2)将合适量的Fmoc-AA-OH形式的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至偶联反应终止；优选地，每种氨基酸的偶联反应时间为1.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学明，伍柯瑾，宓鹏程，陶安进，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44