用于测定豆荚蛋白的血液水平的方法和组合物技术

在一个方面，本文公开了一种用于测定豆荚蛋白分子(天冬酰胺酰肽链内切酶)的血液水平的均相测定方法。在一个方面，所述测定法利用了包被有特异性针对豆荚蛋白分子或它的一种或多种片段的一种或多种抗体的特定尺寸的纳米粒子。在一个方面，所述测定法以均相方式被设计成具有0.2ng/mL至160ng/mL的动态范围。在另一个方面，本文公开了一种用于测定豆荚蛋白的血液水平的试剂盒，所述试剂盒包含两个部分的试剂(R1和R2)，所述试剂盒适于在临床化学分析仪上使用。在一个方面，用于区分诸如乳腺癌、结肠直肠癌以及胃癌之类的癌症的正常风险和高风险的临界值是18ng/mL±3ng/mL。

【技术实现步骤摘要】

在某些方面，本公开涉及用于分析生物分子的方法、试剂盒以及装置。在具体方面，本公开涉及用于测定样品中的豆荚蛋白(legumain)浓度的方法、试剂盒以及装置。在一些实施方案中，基于微粒增强的免疫测定法，如胶乳凝集免疫测定法来测定血液样品中豆荚蛋白的浓度。
技术介绍
豆荚蛋白是在人类中由LGMN基因所编码的一种蛋白质(ChenJ.M.等,J.Biol.Chem.1997；TanakaT.等,Cytogenet.CellGenet.1966；HalfonS.等,FEBSLett.1998)。该基因编码对天冬酰胺酰键的水解具有严格特异性的半胱氨酸蛋白酶，从而在P1位具有Asn或Asp的情况下切割肽键(SchwarzG.等,J.Biol.Chem.2002)。若干种可变剪接转录物变体已经被描述，但是只有两种的生物有效性已经被确定。这两种变体编码相同同工型(YamaneT.等,Biochem.Biophys.Res.Commum.2013)。豆荚蛋白在结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌以及其它类型的癌症中过表达(LiuC.等,CancerRes.2003；MurthyR.V.等,Clin.CancerRes.2005)。豆荚蛋白由基因表达谱分析和肿瘤组织阵列被鉴定为是一种肿瘤生物标志物(GuoP.等,PLoSOne,2013)。哺乳动物豆荚蛋白参与在溶酶体/内体系统中对细菌肽和内源性蛋白质的加工以进行II类MHC提呈。豆荚蛋白已经被观测到是多种类型癌症的一种潜在预测性生物标志物(WuM.等,AsianPac.J.CancerPrev.2014；GawendaJ.等,BreastCancerRes.Treat.2007)。它被证实处在聚集在肿瘤细胞的侵袭伪足处和细胞表面上的膜相关囊泡中，在此它与整合素共定位(LiuY.,Mol.Pharm.2012)。豆荚蛋白的过表达可能与实体肿瘤的形成相关(Liu等,CancerRes.2003)。过表达豆荚蛋白的细胞可以在体外具有提高的迁移和侵袭活性并且在体内采用侵袭性和转移性表型，这表明了豆荚蛋白在肿瘤侵袭和转移中的意义(LinY.等,J.Nat.CancerInst.2014)。还已经证实的是，豆荚蛋白促进细胞迁移，并且过表达与增强的组织侵袭和转移有关(Haugen等,Eur.J.Cancer2015)。豆荚蛋白的独特功能特性和它在许多人类肿瘤中的高水平表达支持它是作为前药激活和肿瘤根除疗法的酶靶标的潜在候选者(ChengLiu等,CancerRes.2003)。研发出将豆荚蛋白可切割的肽底物并入到多柔比星(doxorubicin)上的前药策略(Liu等,NatCommun.2014；Stern等,Bioconjug.Chem.2009)。尽管豆荚蛋白作为靶标对于抗癌药物设计和对这种靶标进行的药物研究的进展来说是有吸引力的，但是缺乏以自动化方式通过临床化学分析仪或自动化免疫分析仪测定豆荚蛋白的血液水平的临床诊断方法。因此，期望研发一种完全自动化的豆荚蛋白测试，所述测试在临床环境中适合于临床化学分析仪或免疫分析仪。
技术实现思路
本
技术实现思路
不意图用于限制所要求保护的主题的范围。根据具体实施方式，包括附图和所附权利要求书中所公开的那些方面，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用以及优势将是显而易见的。在一些方面，本文提供了一种专门针对血液中的人类豆荚蛋白的高度灵敏的和均相的测定法，所述测定法首次允许临床医师使用完全自动化的化学分析仪来测试血液样品中的豆荚蛋白水平，所述分析仪是临床实验室中最常用的分析仪。在一些方面，所述测定法的高灵敏度是经由在胶乳粒度选择、抗体偶联比、特定类型和/或量的凝集增强剂的使用、和/或以适当的温度和/或持续时间进行热应力处理的条件方面对常规的胶乳凝集免疫测定法进行特定的改进而达到的。在一些方面，所述测定法是快速的，总反应时间少于约40分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、或少于约5分钟。在一些方面，本公开涉及一种用于克服胶乳凝集免疫测定法对血液样品中的豆荚蛋白的低灵敏度和高度非特异性的方法。在一些方面，使用这种灵敏的和特异的测定法，首次使用完全自动化的化学分析仪测量了血清样品或血浆样品中循环的豆荚蛋白分子。在一些方面，使用本文所公开的方法，来自乳腺癌患者、结肠直肠癌患者以及胃癌患者的样品中豆荚蛋白的血清水平与来自健康志愿者的样品中豆荚蛋白的水平相比显著升高。在一些方面，首次确定了可以由临床医师使用来评估癌症风险的临床临界值(cut-offvalue)，特别是对于实体肿瘤，如乳腺癌、结肠直肠癌以及胃癌，这些实体肿瘤在血液中的循环豆荚蛋白水平常常显著高于该临界值。在一个方面，本文公开了一种用于测定样品中的豆荚蛋白水平的方法，所述方法包括：1)使含有或疑似含有豆荚蛋白的样品与包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒接触；2)检测与所述微粒接触的所述样品的光学变化或信号变化；以及3)通过将所述光学变化或信号变化与已知水平的豆荚蛋白的校准物相比较来确定所述样品中豆荚蛋白的水平。在一些实施方案中，所述样品是生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品、血清样品或血浆样品。在任何前述实施方案中，所述微粒可以包括多个微粒。在任何前述实施方案中，所述方法可以进一步包括：4)将所述样品中豆荚蛋白的水平与正常参考范围或临界值相比较，其中所述样品来自于患有或疑似患有癌症的受试者，并且所述样品中豆荚蛋白的水平处在所述正常参考范围之外或高于所述临界值则表示所述受试者的癌症风险较高。在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是哺乳动物来源的。在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是人类来源的。在任何前述实施方案中，所述豆荚蛋白可以是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC3.4.22.34]或可以具有天冬酰胺酰肽链内切酶[EC3.4.22.34]活性。在任何前述实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在任何前述实施方案中，所述抗体可以对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋白水解降解片段具有特异性。在任何前述实施方案中，所述抗体片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或scFv。在任何前述实施方案中，所述抗体可以是完全人类抗体。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段可以是重组产生的。在任何前述实施方案中，所述抗体或其片段和/或所述微粒可以与试剂偶联。在一个方面，所述试剂是用于检测的试剂。在一个方面，所述用于检测的试剂用于化学发光检测或荧光检测。在任何前述实施方案中，所述微粒可以是胶乳粒子、金粒子、或磁性粒子。在任何前述实施方案中，所述微粒可以具有在约5nm至约2000nm范围的直径。在具体实施方案中，所述直径可以在以下范围：约5nm至约10nm、约10nm至约20nm、约20nm至约40nm、约40nm至约80nm、约80nm至约100nm、约100nm至约120nm、约120nm至约140nm、约140nm至约160nm、约160nm至约180nm、约180nm至约200nm、约200nm至约220nm、约220nm至约240nm、约240nm至约260nm、约260nm至约280nm、约28本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定样品中豆荚蛋白的水平的方法，所述方法包括：1)使含有或疑似含有豆荚蛋白的样品与包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒接触；2)检测与所述微粒接触的所述样品的光学变化或信号变化；以及3)通过将所述光学变化或信号变化与已知水平的豆荚蛋白的校准物相比较来确定所述样品中豆荚蛋白的水平。

【技术特征摘要】
1.一种用于测定样品中豆荚蛋白的水平的方法，所述方法包括：1)使含有或疑似含有豆荚蛋白的样品与包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒接触；2)检测与所述微粒接触的所述样品的光学变化或信号变化；以及3)通过将所述光学变化或信号变化与已知水平的豆荚蛋白的校准物相比较来确定所述样品中豆荚蛋白的水平。2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品。3.如权利要求2所述的方法，其中所述生物样品是血液样品、血清样品、或血浆样品。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微粒包括多个微粒。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：4)将所述样品中豆荚蛋白的水平与正常参考范围或临界值相比较，其中所述样品来自于患有或疑似患有癌症的受试者，并且所述样品中豆荚蛋白的水平处在所述正常参考范围之外或高于所述临界值则表示所述受试者的癌症风险较高。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白是哺乳动物来源的。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白是人类来源的。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白是天冬酰胺酰肽链内切酶[EC3.4.22.34]。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述豆荚蛋白具有天冬酰胺酰肽链内切酶[EC3.4.22.34]活性。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述抗体对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋白水解降解片段具有特异性。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述抗体片段是Fab、F(ab')2、Fv或scFv。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体是完全人类抗体。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段是重组产生的。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段和/或所述微粒与试剂偶联。16.如权利要求15所述的方法，其中所述试剂是用于检测的试剂。17.如权利要求16所述的方法，其中所述用于检测的试剂用于化学发光检测或荧光检测。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述微粒是胶乳粒子、金粒子或磁性粒子。19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述微粒具有在约5nm至约2000nm范围的直径。20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述微粒具有在约40nm至约400nm范围的直径。21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述微粒是磁性粒子，并且其中所述方法进一步包括一个或多个洗涤步骤。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述检测步骤进一步包括检测化学发光和/或荧光。23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段与所述微粒上可供使用的包被位点的比率是约0.1至约1.0。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段与所述微粒上所述可供使用的包被位点的比率是约0.5至约1.0。25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在所述接触步骤中使用凝集增强剂或刺激剂。26.如权利要求25所述的方法，其中所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙二醇。27.如权利要求26所述的方法，其中所述聚乙二醇的分子量在约600Da至约100,000Da的范围。28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述聚乙二醇的最终浓度在约0.3％至约1.5％(w/v)的范围。29.如权利要求25所述的方法，其中所述凝集增强剂或刺激剂是聚乙烯吡咯烷酮。30.如权利要求29所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量在约10,000Da至约750,000Da的范围。31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮的最终浓度在约0.1％至约3.0％(w/v)的范围。32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中在约30℃至约50℃的温度对包被有所述抗体或其片段的所述微粒进行热应力处理至少约10小时。33.如权利要求32所述的方法，其中在约45℃对包被有所述抗体或其片段的所述微粒进行热应力处理约一天至约五天。34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述样品是来自人类或非人类哺乳动物的血清样品或血浆样品。35.如权利要求5至34中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。36.如权利要求35所述的方法，其中所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌以及肺癌组成的组。37.一种用于测定样品中豆荚蛋白的水平的试剂盒，所述试剂盒包含：第一试剂(R1)，所述第一试剂包含缓冲液，所述缓冲液的pH值在约3.0至约10.0的范围；以及第二试剂(R2)，所述第二试剂包含包被有特异性结合豆荚蛋白或其降解片段的抗体或其片段的微粒。38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述微粒包括多个微粒。39.如权利要求37或38所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。40.如权利要求37至39中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体对哺乳动物豆荚蛋白、人类豆荚蛋白、或其蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：余笑虹，郭芳，
申请(专利权)人：余笑虹，郭芳，
类型：发明
国别省市：美国;US