腺病毒分型基因芯片的制备和用途制造技术

本发明专利技术涉及一种可分型检测腺病毒的基因芯片的制备和用途，其制备方法包括制备不同型别腺病毒的特异性引物和探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系，建立杂交体系。利用本发明专利技术制备的基因芯片可甄别腺病毒的不同型别，包括3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为不同型别腺病毒感染的临床诊断和流行病学调查提供一种新的检测手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及腺病毒分型基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测

技术介绍
腺病毒是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一。它是双螺旋DNA基因组病毒，无囊膜，具有众多的血清型。目前鉴定的有57个血清型，分为7个亚属(A-G)，不同的血清型引起不同的疾病，其中，C、E和B亚属主要引起呼吸道疾病，其它B亚属主要引起尿路感染，A、F和G主要引起消化道感染，D亚属主要引起角膜炎和结膜炎。在人类腺病毒感染中约50％引起相关症状，如流行性角膜炎以及婴儿肠炎也可引起肺炎的流行。因此，准确的判断其型别对腺病毒的早期诊断和治疗具有重要意义。腺病毒致病的潜伏期为3-8天，在潜伏期末和急性感染期传染性最强。我国不同地区先后发生多起腺病毒引起的呼吸道感染传染病疫情，全球也多次暴发腺病毒在新兵中流行，疫情传染性强，传播速度快，严重者会导致死亡。临床上婴幼儿急性上呼吸道感染有5％是腺病毒引起的，在小于5岁的儿童急性呼吸系统疾病中腺病毒一起的肺炎较为严重，在大规模流行时，其病死率较高。若能在感染早期做出正确诊断，进行正确的治疗，可有效地避免其快速传播，可有效控制疫情的发展。因此快速、准确的早期诊断是是控制其快速传播的关键。目前腺病毒检测方法主要有免疫学方法(病毒分离实验、血清中和实验、抗原抗体检测等)，此方法耗时长，操作复杂，不能准确地确定型别；PCR法只能检测一种或几种病原体，不能检测众多的血清型；基因测序主要用于病毒新型别的确定。基因芯片技术具有快速、准确、低成本、高通量的特点，能够快速完成腺病毒不同血清型的分型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对腺病毒分型领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的腺病毒分型基因芯片，能同时甄别5种腺病毒的型别，包括3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒，为腺病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。为了达到上述目的，本专利技术腺病毒分型基因芯片，其制备方法如下：1.步骤一：制备腹泻病毒特异性引物选择腺病毒的hexon基因作为检测靶基因，可以实现腺病毒靶基因片段的扩增。优选4对引物序列及其对应的扩增靶标，其中11型和55型共用1对引物，如表1所示：表1引物序列及对应的扩增靶标2.步骤二：制备特异性寡核苷酸探针根据这五型腺病毒基因序列间的比对及每型腺病毒型内的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。腺病毒特异性探针序列以及对应的靶标，如表2所示：表2寡核苷酸探针序列及对应的靶标3.步骤三：制备寡核苷酸芯片一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3μl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥48小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括腺病毒5条特异性探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量；阴性探针为与腺病毒无关的植物基因序列，用来指示特异性；所有探针的点样量均为3μl，使用前至少在室温放置干燥48小时。表3寡核苷酸探针阵片基质控片基质控片基质控阳性探针阳性探针阳性探针ADV3ADV7ADV14ADV11ADV55内标ADV3ADV7ADV14ADV11ADV55内标ADV3ADV7ADV14ADV11ADV55内标空白对照空白对照空白对照阴性探针阴性探针阴性探针4.步骤四：建立多重不对称PCR体系本专利技术基因芯片中PCR体系的特征为1管多重不对称PCR反应体系。合适的多重不对称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重PCR体系，如表4所示：表4多重不对称PCR体系配方优选的PCR扩增条件为：；95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸5min。5.步骤五：建立杂交体系合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物(5μl)与杂交液(5μl)等体积混合，优选的杂交液各成分为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，10×Denhardt。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。6.步骤六：化学发光显色1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。以上制备的腺病毒分型基因芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B。一个优选的实施方案使用市售的DNA提取试剂盒(磁珠法)提取腺病毒核酸，提取参照相应的试剂盒说明书进行。提取的DNA溶液使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行成像，并运用分析软件判读结果。选择流感病毒、麻疹病毒、40型腺病毒、41型腺病毒和风疹病毒作为样本，利用上述制备的基因芯片进行检测，考察芯片的特异性。制备质粒DNA灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。结果：腺病毒的检测限均为3×1000copies/反应。使用本专利技术制备的基因芯片分型3、7、14、11、55型腺病毒样本(全血)。本芯片法分型五种腺病毒样本，直接从全血样本中提取腺病毒核酸，与测序结果一致，经多重不对称RT-PCR扩增后与基因芯片杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可以分型检测腺病毒的基因芯片，本专利技术的基因芯片可以用于同时分型检测3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒。其特征是包含分型检测腺病毒的4对特异性引物和1对内源性内标引物，其中11型和55型腺病毒共用1对引物；5条腺病毒特异性寡核苷酸探针；1条片基质控探针，1条阳性对照探针，1条空白对照探针，1条阴性对照探针，1条内源性内标探针和载体。上述探针分别分布在载体上。表1  3型腺病毒扩增引物表2  7型腺病毒扩增引物表3  14型腺病毒扩增引物表4  11和55型腺病毒扩增引物表5  内标扩增引物表6  腺病毒特异性寡核苷酸探针序列

【技术特征摘要】
1.一种可以分型检测腺病毒的基因芯片，本发明的基因芯片可以用于同时分型检测3型腺病
毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒。其特征是包含分型检测腺病
毒的4对特异性引物和1对内源性内标引物，其中11型和55型腺病毒共用1对引物；5条
腺病毒特异性寡核苷酸探针；1条片基质控探针，1条阳性对照探针，1条空白对照探针，
1条阴性对照探针，1条内源性内标探针和载体。上述探针分别分布在载体上。
表13型腺病毒扩增引物
表27型腺病毒扩增引物
表314型腺病毒扩增引物
表411和55型腺病毒扩增引物
表5内标扩增引物
表6腺病毒特异性寡核苷酸探针序列
2.根据权利1所述的腺病毒分型检测基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃
片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。
3.腺病毒分型检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载以上五型腺病毒基因序列，使
用VectorNTIAdvance10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各型
别腺病毒基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷
酸探针、特异性引物。
步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂，
以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’末端T进行氨基修饰外，5’端同时
标记生物素标记；
步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μl探针溶液，
和10μl芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上
10样品孔阵列膜，用PersonalArrayerTM16个人点样仪(博奥生物有限公司)，将探针点制
在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，
点制好的芯片常温干燥保存。
4.根据权利要求3所述的腺病毒分型检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中5条特异
性寡核苷酸探针及4对引物，探针长度在17-20nt，引物长度在20-24nt。
5.根据权利要求3所述的腺病毒分型基因芯片的制备方法，其特征是步骤三种所述的载体为
醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6.腺病毒分型基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：
1)步骤一，腺病毒核酸的提取，使用市售商品化病毒基因组DNA提取试剂盒提取腺病
毒核酸；
2)步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，陈晓飞，刘琪琦，陈苏红，周标，徐胜平，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11