一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法及其应用。本发明专利技术的制备方法为：将骨髓间充质干细胞移植到PLGA支架，通过控制骨髓间充质干细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等探索出适合骨髓间充质干细胞定向分化的最适条件，观察骨髓间充质干细胞和PLGA支架的生物相容性、诱导过程细胞形态变化、胰岛β细胞诱导液对细胞增殖的影响以及诱导分化细胞特异性基因、蛋白和功能的获得。本发明专利技术在最适条件下将骨髓间充质干细胞种植在PLGA支架上，经胰岛β细胞诱导液培养后分化获取了一种具有高糖反应性、可用于治疗移植的胰岛β细胞，为治疗糖尿病带来了希望。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学工程
，具体涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，及其应用。
技术介绍
糖尿病是危害人类身心健康的主要慢性疾病之一，重建糖尿病患者体内的功能性胰岛细胞功能是治疗糖尿病的理想目标。恢复糖尿病患者体内胰岛功能的主要有3种途径：胰腺移植、胰岛移植及干细胞移植。由于供体来源缺乏、移植后排斥反应等不足，胰腺移植和胰岛移植方案在临床上的推广应用受到限制，使干细胞移植成为替代治疗的研究重点。骨髓间充质干细胞因具有多向分化潜能、免疫原性弱、不存在伦理争议等优势，成为干细胞移植治疗糖尿病的一种理想细胞来源。国内外学者均采用骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞对1型糖尿病患者进行了探索性的治疗研究，发现在治疗后患者的胰岛细胞功能有显著提高。然而，目前的干细胞定向分化仍然存在几大问题：其一是分化效率较低，无法产生足够数量的胰岛素分泌细胞；其二诱导分化形成的胰岛素分泌细胞寿命较短；其三是胰岛素分泌细胞没有高糖反应性，即血糖升高时，胰岛素分泌细胞无法反应性增加胰岛素的分泌。随着组织工程学的发展，将干细胞与可降解的生物材料相结合，最终形成模拟胰腺功能的替代组织成为了可能。目前组织工程的研究仍处于初级阶段，还有很多问题需要解决：首先是材料的筛选，即如何筛选出适合胰腺组织构建的理想的生物材料；再次是生物材料与干细胞结合后，干细胞正常生理特性的维持。其中材料问题是首先要解决的基本问题。目前国内外关于干细胞与生物材料相结合诱导分化形成胰岛素分泌细胞的文献报道甚少。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料及其制备方法，本专利技术的另一目的在于提供该组织工程材料在促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛细胞中的应用。本专利技术的主要技术方案是在聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)支架上诱导分化骨髓间充质干细胞定向分化形成胰岛β细胞，为治疗糖尿病提供合适移植来源。本专利技术选用一种能够支持细胞的增殖、分化和生物合成的PLGA支架，具有生物可降解性、良好的生物相容性、可加工性等优点。PLGA是一种可降解的生物支架材料，但在体外培养条件下随着培养环境的改变和时间的推移会逐渐的萎缩和降解。而且骨髓间充质干细胞在PLGA上的生长是否良好亦受种植的时间、浓度、方式很大的影响。因此，控制骨髓间充质干细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等，是应用PLGA支架诱导分化形成胰岛β细胞的关键。本专利技术的第一方面，是提供一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：用NaCl颗粒制孔或浸出法制备多孔PLGA支架，具体步骤如下：将聚乳酸羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)，其中聚乳酸(PLA):羟基乙酸(PGA)体积比为85:15，溶于1,4二氧六环溶液中,配制成PLGA浓度为10％(w/v)的溶液，PLGA的分子量15KD。向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为100～250μm，比例为25％-75％(w/w)的NaCl颗粒，优选粒径为150～200μm，比例为50％(w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液,倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿。室温下干燥24小时以上(最佳为48h),冷冻干燥24小时以上(最佳为48h)。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上(最佳为48h),搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存，得到可用于骨髓间充质干细胞培养的多孔PLGA支架。经实验证明，大鼠骨髓间充质在不同孔径和孔径率PLGA支架上向胰岛β的诱导分化，扫描电镜观察支架和细胞形态、实时定量PCR检测Ins1基因的表达，得出适应骨髓间充质干细胞培养的PLGA支架。本专利技术的第二方面，是提供根据上述的制备方法制备得到的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料。本专利技术的第三方面，是提供了上述的组织工程材料在促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛细胞中的应用。该应用包括：利用上述的组织工程材料促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛β细胞的方法；本专利技术还提供了一种利用上述的组织工程材料(即多孔PLAG支架)诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，具体方法如下：A.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定全骨髓贴壁培养法分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞。(具体方法参见SoleimaniM,NadriS.Aprotocolforisolationandcultureofmesenchymalstemcellsfrommousebonemarrow.NatProtoc.2009；4:102–106.)，具体步骤为：将大鼠麻醉后处死，置于75％酒精中浸泡15min。分离股骨和胫骨，PBS冲洗后，剪去干骺端，2ml医用注射器吸取培养基冲洗骨髓腔。将悬液过滤后，2000rpm/min×5min离心，沉淀吹打混匀后种于培养瓶中培养。骨髓间充质干细胞贴壁率达到70％后传代。传至第三代(P3)后对培养获取的骨髓间充质干细胞分别进行形态学、表面标志物、功能鉴定。B.大鼠骨髓间充质干细胞在多孔PLAG支架表面进行诱导分化取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到上述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5×105个/24孔大小支架或4.5×104个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(αMEM+10％FBS)换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A(1mL培养基/24孔板或者0.1mL培养基/96孔板)诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B(1mL培养基/24孔板或者0.1mL培养基/96孔板)继续诱导10天，每3天换液一次；其中胰岛β细胞诱导液A：含有10％FBS，1％非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)，3％B27，30ng/ml成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)，3mmol/LL-谷氨酰胺(L-glutamine)的αMEM。胰岛β细胞诱导液B：含10％FBS，10ng/mlβ-动物纤维素(β-cellulin)，10ng/ml激活素A(activinA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，该制备方法如下：将聚乳酸羟基乙酸，溶于1,4二氧六环溶液中,配制成聚乳酸羟基乙酸浓度为10％w/v的溶液，所述的聚乳酸的分子量为15KD，其中聚乳酸：羟基乙酸的体积比为85:15；向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为100～250μm，比例为25％‑75％w/w的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cm×8cm的培养皿；室温下干燥24小时以上，冷冻干燥24小时以上；脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上,搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存，得到可用于骨髓间充质干细胞培养的多孔PLGA支架。

【技术特征摘要】
2014.08.22 CN 20141041569111.一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，该
制备方法如下：
将聚乳酸羟基乙酸，溶于1,4二氧六环溶液中,配制成聚乳酸羟基乙酸浓
度为10％w/v的溶液，所述的聚乳酸的分子量为15KD，其中聚乳酸：羟基乙
酸的体积比为85:15；
向上述浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为
100～250μm，比例为25％-75％w/w的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒
入尺寸为8cm×8cm的培养皿；室温下干燥24小时以上，冷冻干燥24小时以
上；脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上,搅拌烧杯
中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，
密封保存，得到可用于骨髓间充质干细胞培养的多孔PLGA支架。
2.根据权利要求1所述的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材
料的制备方法，其特征在于所述的加入NaCl颗粒的粒径为150～200μm，占
浓度为10％w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液的比例为50％w/w。
3.权利要求1或2的制备方法得到的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组
织工程材料。
4.一种如权利要求3所述的组织工程材料在诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向
分化成胰岛β细胞中的应用。
5.一种利用权利要求3所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向
分化成胰岛β细胞的方法，具体方法如下：
A.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
全骨髓贴壁培养法分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞。传至第三代P3后
对培养获取的骨髓间充质干细胞分别进行形态学、表面标志物、功能鉴定；
B.大鼠骨髓间充质干细胞在多孔PLAG支架表面进行诱导分化
取P3代大鼠骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：石勇铨，刘浩琪，汤玮，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31