一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗，所使用的I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID50效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型及禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。本发明专利技术制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，三联苗无明显差异，均稳定有效；效力试验结果证明，三联苗和三种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗。
技术介绍
鸡新城疫具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。禽流感是由A型流感病毒引起的、主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很大。通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，可通过水平和垂直两种途径传播，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围也越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病，特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。许多I群禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但是I群4型禽腺病毒例外，可直接引起鸡群发病，主要病变表现为心包积液和肝、肾肿大，本病于1963年首次在美国发生，随后在世界各地相继出现，是全世界家禽和野禽常见的传染病原。1976年我国台湾省首次发生本病，之后全国各地均有发生本病的报道，且呈逐年上升趋势，给鸡养殖业带来严重的危害。近些年来，鸡新城疫、H9亚型禽流感是较为常见的严重威胁家禽的2种重要疾病；而鸡群对I群4型禽腺病毒的感染愈来愈多，此病很容易引起继发感染疫病，给禽业养殖户带来很多烦恼，而且多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的注射应激,还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，所以需要筛选获得新的流行毒株来应对变异所造成的新的危害。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的三联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒；其中鸡新城疫病毒优选为鸡新城疫病毒LaSota株；其中禽流感病毒优选为H9亚型禽流感病毒QDY株(Avianinfluenzavirus)，于2015年4月29日保藏在中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201517。禽腺病毒为I群4型禽腺病毒YBAV-4株，于2015年10月15日保藏在中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNo.V201541。上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；本专利技术的灭活疫苗的制备方法如下：1)油相制备：取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80(Span-80)，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后完成油相制备；2)水相制备：将灭活的新城疫病毒液、禽流感病毒液、I群禽腺病毒毒液混合；取混合抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；其中新城疫病毒液、禽流感病毒液、I群禽腺病毒的数量比优选为1:1:2；3)乳化取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30～40分钟完成乳化制备。本专利技术的疫苗所使用的H9亚型禽流感病毒QDY株和I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID50/EID50效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型及禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。本专利技术制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，三联苗无明显差异，均稳定有效；效力试验结果证明，三联苗和三种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。具体实施方式申请人筛选获得了一株新型变异的I群4型禽腺病毒，将该病毒与鸡新城疫病毒、禽流感病毒一起来制备联合疫苗，从而促成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：YBAV-4株毒株的筛选1、流行病学调查自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。2010年，专利技术人从山东淄博某养殖场有包涵体肝炎和心包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病毒。2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液以0.2ml/胚的剂量，经卵黄囊途径接种6.5日龄SPF鸡胚，弃24h内死胚，取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，－20℃保存。3、病毒的鉴定3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液5～10ml，反复洗3～5次，末次用生理盐水将血细胞泥稀释成0.8％、1％和2％浓度，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76为凝集反应阳性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。3.2理化特性检验参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别以5-溴尿嘧啶-2’-脱氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1h)处理后，接种鸡胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结果：分离毒分别经BUDR、氢氧化钠(pH10)和60℃、1h处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR检测阴性。表明BUDR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1h可被灭活。而经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在鸡胚中的增殖，出现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。3.3血清学鉴定3.3.1群特异性鉴定利用琼脂凝胶扩散试验(AGP)制备琼脂凝胶平板对分离毒株进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加Ⅰ群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37℃作用，24～48h观察是否出现凝集沉淀线。结果：分离毒抗原仅能与Ⅰ群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。3.3.2型特异性鉴定Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按2010年版本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗，其抗原为灭活的鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒。

【技术特征摘要】
1.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗，其抗原为灭活的鸡新城
疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒。
2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的鸡新城疫病毒为鸡
新城疫病毒LaSota株。
3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的禽流感病毒，其保
藏编号为CCTCCNO:V201517。
4.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒的保藏编
号为CCTCCNo.V201541。
5.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒的灭活采用甲
醛灭活。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓，李陆梅，程增青，刘新文，胡潇，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37