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一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用制造技术

技术编号:14986642 阅读:193 留言:0更新日期:2017-04-03 18:14
本发明专利技术涉及一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用,包括以下步骤:S01.对玻碳电极进行预处理;S02.采用循环伏安法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极;S03.分别制备浓度为1~10μM的Ru(bpy)32+标记的B-DNA信标,和浓度为1~10μM的二茂铁标记的C-DNA信标;S04.将所述步骤S02所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A-DNA中培育3~6h,然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)32+标记的B-DNA信标和二茂铁标记的C-DNA信标20~40min。可以用来检测内切酶EcoRI和ApaI。本发明专利技术的传感器具有良好的稳定性、重现、对内切酶EcoRI和ApaI具有很高的特异性,不易收到检测样品中其他物质的干扰;灵敏度极强;而且检测时操作简单方便快速,对抗菌抗病毒药物的研发有一定的帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学与电化学发光传感器分析领域,具体涉及一种基于金纳米-石墨烯复合材料的检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备方法与应用。
技术介绍
内切酶,是一类主要存在原核生物中的核酸。它作为分子剪刀闻名,并用于在特定的位置来剪切磷酸酯键。内切酶已经被广泛用于PCR实验、基因谱、医药化学、催化放大技术等。内切酶在原核生物中起到保护生物内在的基因抵抗外来基因的作用。因此内切酶被认为是在新的抗菌、抗病毒药物的发现领域中重要的目标物质。目前对内切酶检测的研究的方法包括高效液相发、荧光共振转移、基于金纳米颗粒的比色法等等。虽然这些方法能够很准确的检测内切酶,但是他们都存在一些缺点比如需要复杂的设备,复杂的处理过程,昂贵的价格等等。电化学发光(ECL)综合了电化学和化学发光的优点即低背景、容易控制和检测,最近已经在生物传感器领域内得到了很好的发展。尤其是基于猝灭或者是增强三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)/三正丙胺(TPrA)的电化学发光的强度,已经被很好的研究了。已经有很多方法用来制备石墨烯,在这些方法中化学还原氧化石墨烯(GO)是最方便的方法。这中方法可以得到大量的石墨烯片。然而由于无论是在溶液中还在干粉的石墨烯都很溶液团聚,这个现象大大阻碍了石墨烯的实际应用。在石墨烯片层结构中引入纳米金属,最开始是为了分开单层的石墨烯。然而现在,人们已经认识到在石墨烯上沉积金属纳米颗粒也可能生成新的催化材料、磁性材料、导电材料等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用一解决目前对内切酶的检测设备和处理过程复杂、价格昂贵等问题。一种检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,包括以下步骤:S01.对玻碳电极进行预处理;S02.采用循环伏安法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极;S03.分别制备浓度为1~10μM的Ru(bpy)32+标记的B-DNA信标,和浓度为1~10μM的二茂铁标记的C-DNA信标;S04.将所述步骤S02所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A-DNA中培育3~6h,然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)32+标记的B-DNA信标和二茂铁标记的C-DNA信标20~40min,即得到检测内切酶的电化学发光生物传感器。用于检测内切酶EcoRI时各DNA序列分别为:巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAGGAATTCCGGGTTGGG-3’;所述Ru(bpy)32+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’;所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCGGAATTCCT-(CH2)6-NH2-3’。其中A-DNA序列中的GGGGTTGGGGAAGGG和B-DNA互补配对;A-DNA序列中的AGGAATTCCGGGTTGGG-3’和C-DNA互补配对,A-DNA序列中的GGAATTCC和C-DNA序列中的GGAATTCC是内切酶的识别序列。用于检测内切酶ApaI时各DNA序列分别为:巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAGGATCCGGGTTGGG-3’;所述Ru(bpy)32+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’;所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCGGATCCT-(CH2)6-NH2-3’。其中A-DNA序列中的GGGGTTGGGGAAGGG和B-DNA互补配对;A-DNA序列中的AGGATCCGGGTTGGG-3’和C-DNA互补配对,A-DNA序列中的GGATCC和C-DNA序列中的GGATCC是内切酶的识别序列。还可以用其他内切酶的识别序列替换A-DNA和C-DNA中相应内切酶识别序列位置,从而用于检测其他的内切酶。金纳米-石墨烯复合材料,即有石墨烯所用良好的性质,独特的结构使其具有优异的电学、热学、力学以及化学性质,而且在和金纳米的相互作用下,这些性质有明显的增强。而且金纳米能够提供巯基修饰的DNA分子修饰的位点。在本专利技术中,电极表面的金纳米和巯基修饰的A-DNA通过Au-S化学键的结合可以有效的固定DNA信标。Ru(bpy)32+是一种稳定的、发光效率非常高的发光剂,由于其分子量和分子空间体积较酶等标记小很多,且不影响核酸的特异性和杂交活性,使得Ru(bpy)32+在分子水平上对核酸进行标记而成为可能。再加上Ru(bpy)32+可在电化学发光反应中进行再生循环反应,使得一个标记物在每一个检测周期中会产生相当数量的光子,因而分析灵敏度很高。在本专利技术的方法中,利用Ru(bpy)32+标记B-DNA不仅不会影响DNA的配对互补,而且还能增强检测反应的灵敏度。二茂铁是一种具有芳香族性质的有机过渡金属化合物,当二茂铁存在时,其通过电子转移使Ru(bpy)32+从激发态失活回到基态,无法产生磷光,因此二茂铁可以作为Ru(bpy)32+的发光猝灭剂。通过本专利技术方法制备的电化学发光生物传感器,由于Ru(bpy)32+标记在B-DNA上,二茂铁标记在C-DNA上,A-DNA、B-DNA和C-DNA能够互补形成双链结构,因此二茂铁对Ru(bpy)32+发光剂的猝灭得以实现,使得制备的生物传感器处于“光信号关闭”状态。当将该生物传感器浸入内切酶检测液中一定时间后,内切酶会在识别序列处剪断双链结构从而释放二茂铁分子,导致猝灭减弱,该生物传感器转化为“光信号开启”状态,从而实现对内切酶的特异性检测。Ru(bpy)32+标记的B-DNA溶液的浓度为1~10μM,二茂铁标记C-DNA溶液的浓度为1~10μM。如果浓度太低,在电极表面修饰的B-DNA和C-DNA就会太少,当定量检测时信号变化就不大;浓度太大,在电极表面修饰的B-DNA和C-DNA太多增大了空间位阻,内切酶反而不容易进入到体系使信号变化不大。步骤S01所述对玻碳电极进行预处理方法为:将玻碳电极用α-A12O3抛光粉抛光;洗涤,分别在去离子水和乙醇中超声10min。进一步的,所述金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极的制备方法为:采用浓度为0.5~1mgmL-1的氧化石墨烯和20~60mM氯金酸,在-1.5~0.5V的范围内通过循环伏安法金纳米-石墨烯沉积到玻碳电极表面,扫描速度10mVs-1。进一步的,步骤S03所述Ru(bpy)32+标记的B-DNA的信标的制备方法如下:S11.将Ru(bpy)2Cl2、碳酸氢钠和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸混合均匀,加入乙醇-水溶液中加热回流后冷却过滤制备Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2;S12.将N,N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌混合后加入DMF溶液使其充分溶解后加入步骤S11所得Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2中合成Ru(bpy)2(dcbpy)NHS;S13.将步骤S12所得Ru(bpy)本文档来自技高网...
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【技术保护点】
一种检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S01.对玻碳电极进行预处理;S02.采用循环伏安法制备金纳米‑石墨烯修饰的玻碳电极;S03.分别制备浓度为1~10 μM的 Ru(bpy)32+标记的B‑DNA信标,和浓度为1~10 μM的二茂铁标记的C‑DNA信标;S04.将所述步骤S02所得到金纳米‑石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A‑DNA中培育3~6 h,然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)32+标记的B‑DNA信标和二茂铁标记的C‑DNA信标20~40min,即得到检测内切酶的电化学发光生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S01.对玻碳电极进行预处理;
S02.采用循环伏安法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极;
S03.分别制备浓度为1~10μM的Ru(bpy)32+标记的B-DNA信标,和浓度为1~10μM的二茂铁标记的C-DNA信标;
S04.将所述步骤S02所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A-DNA中培育3~6h,然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)32+标记的B-DNA信标和二茂铁标记的C-DNA信标20~40min,即得到检测内切酶的电化学发光生物传感器。
2.根据权利要求1所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,所述巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAGGAATTCCGGGTTGGG-3’;所述Ru(bpy)32+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’;所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCGGAATTCCT-(CH2)6-NH2-3’。
3.根据权利要求1所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,所述巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAGGATCCGGGTTGGG-3’;所述Ru(bpy)32+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’;所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCGGATCCT-(CH2)6-NH2-3’。
4.根据权利要求2或3所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,所述金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极的制备方法为:采用浓度为0.5~1mgmL-1的氧化石墨烯和20~60mM氯金酸,在-1.5~0.5V的范围内通过循环伏安法将金纳米-石墨烯沉积到玻碳电极表面,扫描速度10mVs-1。
5.根据权利要求2或3所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤S03所...

【专利技术属性】
技术研发人员:高文华李英杰陈耀文鲁福身张歆陈汉佳
申请(专利权)人:汕头大学
类型:发明
国别省市:广东;44

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