一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法技术

一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，用于牛奶及乳制品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测。通过将该两种菌适配体分别与NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu时间荧光分辨纳米材料偶联形成信号探针，同时该两种适配体与Fe3O4磁性纳米材料偶联形成捕获探针，当存在目标物质时，由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成“三明治”夹心复合物。通过监控544nm和615nm处荧光信号强度，能够定量检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，两者的线性范围分别为10

【技术实现步骤摘要】

一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，涉及纳米材料和分析化学
，用于对食品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行同时检测。
技术介绍
食源性疾病通常指随着食物摄入人体的生物性、物理性、化学性有毒有害物导致人体感染或中毒的疾病。食源性致病菌就是能引起食物中毒或感染的致病性细菌。鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是最常见的引起食源性疾病的致病菌。鼠伤寒沙门氏菌是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，周身鞭毛，无荚膜，最适生长温度是34℃～37℃，最适pH为7.0～7.8。沙门氏菌生长能力很强，且对环境的抵抗力强，甚至可以在低温、缺氧和干旱条件下存活4个月。它是一种人畜共患致病菌，可污染食品并大量繁殖，其致病机制是随食物经口进入人体后会随淋巴系统进入血液，造成人体感染，不仅如此，鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道后菌体裂解后会产生大量内毒素，内毒素作用于肠粘膜引发宿主全身性炎症，出现中毒症状。由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒具有发病率高，发病时间短等特点。金黄色葡萄球菌是一种需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌，最适生长温度是30℃～37℃，最适pH为7.0～7.5,是葡萄球菌属中最重要的致病菌之一。由于金黄色葡萄球菌可在有氧或无氧的环境中生长，高度耐盐、并且对温度(6.5℃～46℃)和pH(4.2～9.3)要求很低，因此能广泛的存在于食品当中。金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌，可引起许多严重的感染，其致病机制是侵袭人体后引起化脓性感染，通过分泌肠毒素等外毒素和酶类造成急性肠炎，引起呕吐、腹泻等；或者菌体直接侵入人体，引起化脓性感染、肺炎、肠炎等。根据相关数据统计，金黄色葡萄球菌在全球范围内为仅次于大肠杆菌第二常见的与食品中毒相关的病原体。目前，食源性致病菌的测定方法主要有平板计数法，聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增方法(LAMP)、免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光技术(IFT)、胶体金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离技术(IMB)等。其中ELISA已被高度商业化，成为目前食品安全、环境监测、医疗诊断中常用的检测方法，它结合了酶催化作用的高效性和抗原抗体反应的特异性，达到快速灵敏检测的目的，但ELISA方法检测致病菌仍然需要足够数量的细菌进行反应，因此在检测前需要进行预增菌培养阶段，此工序费力且耗时较长，限制了其进一步应用。ELISA与GICA都是基于抗原抗体亲和反应，一抗体作为识别分子易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或细胞实验，繁琐费时，成本较高，因此检测成本也偏高。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法很有必要。核酸适配体(Aptamer)通过SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，指数富集配体系统进化)技术筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相较，核算适配体有诸多优点，比如体外合成周期短，制备成本低，无需动物实验；稳定性好，对温度不敏感；易于修饰等等，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。时间分辨荧光是一种特殊的荧光现象，是利用物质的荧光寿命长短进行时间分辨，即采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度-时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱，用于对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分实现分辨并可分别进行测定；通过设置合理的延迟时间(Delaytime)和门控时间(Gatetime，也称检测时间)消除了检测环境中杂质自发荧光和背景荧光对信噪比的干扰，从而提高分析方法灵敏度。时间分辨荧光分析技术发展的关键在于镧系元素荧光探针和分析模式的有效开发和结合利用。随着纳米技术的蓬勃发展，具有良好水分散性的镧系纳米材料作为一类新型发光标记物，其固有的时间分辨光学特性逐渐被开发并利用起来。镧系掺杂纳米材料本身具有诸多优越的理化特性，比如水分散性好、荧光寿命长、耐光漂白，斯托克斯位移宽(～300nm)，生物兼容性好，细胞毒性低，多色可调控(掺杂元素种类和比例)，有利于生物体系中多组分同时检测。鉴于上述优点，新型镧系掺杂的荧光纳米材料具备了良好的时间分辨荧光分析应用前景。磁性纳米材料的物理长度恰好处于纳米量级且具有制备方法简单、原料低廉、独特的超顺磁性、表面易于修饰、生物相容性好等特点，使得其在生物医学领域具有广阔的应用前景。本专利技术构建了一种新颖的、灵敏的时间分辨荧光生物分析法同时检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。首先合成了两种不同基质和掺杂不同镧系元素的具有时间分辨荧光功能的纳米材料，该纳米材料可同时采用273nm的紫外光进行激发，并设定一定的门控时间和延迟时间可分别在544nm和615nm处有非常强且窄的发射峰。对纳米材料表面进行亲和素修饰，再将5’端生物素化的目标寡核酸适配体链与亲和素化的纳米材料通过亲和素和生物素的作用形成时间分辨荧光探针。采用类似的方法用目标适配体修饰磁性材料作为捕获探针。由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料“三明治”夹心复合物。在酶标仪的时间分辨荧光模式下，以273nm进行激发，记录544nm和615nm处荧光信号强度，通过对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，建立标准曲线，达到对含鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌样品进行定量检测的目的。该专利技术可以用于禽畜肉类、饮品类、牛奶及乳制品等样品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌含量的检测。
技术实现思路
一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法:分别制备得到NaYF4:Ce/Tb，NaGdF4:Eu时间分辨荧光纳米材料和Fe3O4磁性纳米材料，对时间荧光分辨纳米材料和磁性纳米材料进行表面功能化修饰并与亲和素(Avidin)偶联，随后通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的作用与生物素(Biotin)修饰的适配体DNA特异性结合分别构成荧光探针和捕获探针。适配体固定到磁性纳米材料表面，用于捕获和富集鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu分别标记鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，加入目标菌进行孵育，由于是适配体对目标菌体的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料复合物。采用酶标仪在时间分辨荧光的模式下，用273nm的激发光，并设定延迟时间为100μs，检测时间为1000μs，可分别在544nm和615nm得到Tb和Eu的特异性发射峰，并且在一定范围内鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的含量与荧光强度的数值相关，基于此对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准品进行检测，建立标准曲线，已达到对实际样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行定量检测的目的。步骤为：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，其特征在于：将两种致病菌即鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体分别与NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu时间荧光分辨纳米材料偶联形成信号探针，同时鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体与Fe3O4磁性纳米材料偶联形成捕获探针，当存在鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌时，由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成磁性材料‑适配体‑菌体‑适配体‑时间分辨荧光纳米材料“三明治”夹心复合物。在酶标仪的时间分辨荧光模式下，以273nm进行激发，记录544nm和615nm处荧光信号强度，实现对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，建立标准曲线，达到对含鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌样品进行定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，其特征在于：将两种致病菌即鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体分别与NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu时间荧光分辨纳米材料偶联形成信号探针，同时鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌适配体与Fe3O4磁性纳米材料偶联形成捕获探针，当存在鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌时，由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料“三明治”夹心复合物。在酶标仪的时间分辨荧光模式下，以273nm进行激发，记录544nm和615nm处荧光信号强度，实现对不同浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，王晓乐，吴世嘉，段诺，夏雨，马小媛，孙炜佳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32