高活性纤维二糖水解酶的制备方法及高活性纤维二糖水解酶技术

本发明专利技术的课题在于提供一种高活性的纤维二糖水解酶。通过将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰置换为丙氨酸，可以提高纤维二糖水解酶的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物炼制(biorefinery)的糖化酶。特别是涉及提高了活性的纤维二糖水解酶的制备方法以及具有高活性的纤维二糖水解酶。
技术介绍
通过基因重组技术，能够进行各种各样的蛋白质改性。针对酶也进行了提高活性、增加表达量等增强酶活性的尝试。采取如下手法作为提高酶活性的手法：改变氨基酸，向酶与底物结合的活性中心的氨基酸导入变异，从中选择高活性的酶。酶的底物结合部位在大多数情况下被比作钥匙-锁状。另一方面，人们已知在对纤维素等高分子底物起作用的酶当中，虽然仅限于极少部分的酶，但它们为具有高分子底物嵌入的隧道状或沟状的相对较长的底物结合部位的酶。从端部切断纤维素链的酶、即外切葡聚糖酶的反应产物是纤维二糖，也被称为纤维二糖水解酶。纤维二糖水解酶的活性中心形成如上所述的隧道状，通过酶反应而被切断的纤维二糖从隧道的相反一侧出来，因此，酶反应持续进行，而纤维二糖水解酶不会从纤维素链脱离。至今为止一直在进行提高纤维二糖水解酶的酶活性的尝试，并已经报道了几种变异体。例如，篮状菌(Talaromyces)相关的变异体(参照美国专利第8790894号说明书)、来源于革菌(Phanerochaete)的纤维二糖水解酶的变异体相关的变异体(参照日本专利公开公报特开2010-046034号公报)等。
技术实现思路
然而，在生物炼制领域中需要一种更高效的酶，而在现有技术中活性提高的效果并不充分。因此，有必要制备一种活性更高的纤维二糖水解酶变异体。更进一步，像纤维二糖水解酶那样，在保持高分子底物的同时进行催化反应的进行性酶(processiveenzyme)在大范围上存在的部位构成底物结合部位，因此，还大量存在其效果没有得到研究的氨基酸。因此，本专利技术的课题在于对未被研究的氨基酸部位的置换效果进行调查，获取一种具备较高活性的纤维二糖水解酶。本专利技术的制备提高了活性的纤维二糖水解酶的方法的特征在于：将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰置换为丙氨酸。使用作为确定影响蛋白质功能的部位的一方法的丙氨酸扫描(Alanine-scanning)进行解析后发现：通过将作为由序列号1所示的纤维二糖水解酶的第62位氨基酸的天门冬酰胺置换为丙氨酸，能够获得一种具备高活性的纤维二糖水解酶。该氨基酸残基位于纤维二糖水解酶的隧道结构内。因此，可以推测只要是与由序列号1所示的纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶，通过将与该位置对应的位置的天门冬酰胺置换为丙氨酸，同样能够获得高活性的纤维二糖水解酶。另外，本专利技术的提高了活性的纤维二糖水解酶的特征在于具备下述变异：将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰置换为丙氨酸。将序列号1所示的序列的第62位的天门冬酰胺置换为丙氨酸后的纤维二糖水解酶具有高活性。因此，通过将第62位的天门冬酰胺或者对应于该位置的天门冬酰胺置换为丙氨酸后的变异体、或者除了包括该置换还进一步组合已知酶活性增强的氨基酸置换，能够获得活性更高的纤维二糖水解酶。本专利技术的提高了活性的纤维二糖水解酶的特征在于，其序列由序列号2所示。由序列号2所示的纤维二糖水解酶与野生型酶相比具有12倍的比活。附图说明图1为示意性地表示纤维二糖水解酶的立体结构以及表示各氨基酸残基(aminoacidresidue)位置的图。图2为表示利用丙氨酸扫描(alaninescanning)获得的纤维二糖水解酶变异体相对野生型的相对活性比的图。图3为表示通过置换了从N末端起第62位的氨基酸后相对野生型的相对活性比的图。具体实施方式人们已知纤维二糖水解酶的晶体结构。纤维二糖水解酶与作为底物的纤维素相互作用的部位受长环(loop)包围，因而被称为隧道结构。与纤维素结合并发生分解反应的活性中心位于隧道结构内部。所以，可以认为通过获得隧道结构内的氨基酸具有变异的酶，就能够获得高活性变异体。然而，由于隧道结构跨越了大范围，要对与底物结合并影响活性的氨基酸都进行解析是比较困难的。因此，基于立体结构，选择预测存在于隧道结构内、并且对相对作为底物的纤维素的移动构成障碍从而影响活性的可能性较高的氨基酸，通过丙氨酸扫描进行解析。首先，为了导入变异，分离纤维二糖水解酶基因，构建通过米曲霉(Aspergillusoryzae)表达的载体。(1)构建通过米曲霉表达纤维二糖水解酶的载体(vector)(提取纤维顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)的基因组DNA)将纤维顶孢霉的H1菌株(FERMBP-11508，以下简称“H1菌株”)接种到PDB琼脂培养基(在PDA培养基(BDDifco公司制，PDAbroth)中添加了1.5％(质量/体积)的琼脂糖(agarose)的平板培养基)上，在30℃下培养一周。将得到的菌体以每个琼脂直径5mm为单位进行切取，并接种于PDA培养基中，以30℃下、130rpm进行摇瓶培养(shakingculture)。以15000rpm对培养物进行10分钟离心分离处理，由此回收菌体。更进一步，通过PDA培养基重复清洗回收的菌体两次，从而获取菌体试样。在装入有该菌体的2mL容量的塑料试管中加入研磨珠，利用台式珠磨粉碎机(Shakemaster，生物科学社制)实施90秒的粉碎处理三次，将菌体试样磨成粉末状后，使用Nucleon(Amersham公司制)提取DNA。(纤维顶孢霉的野生型纤维二糖水解酶的DNA克隆)将获得的基因组作为模板，使用序列号3、4(参照下述表1)所示的引物(primer)1、2，通过PCR扩增编码野生型的纤维二糖水解酶的序列。使用KOD-plus(东洋纺公司制备)作为DNA聚合酶(DNApolymerase)，PCR通过以下方式进行，以94℃、2分钟进行1个循环后，以96℃、20秒，接着60℃、30秒，进一步72℃、5分钟进行30个循环。得到的PCR产物利用QIA快速PCR产物纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit，QIAGEN公司制备)进行提纯。得到的纤维顶孢霉的野生型纤维二糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高了活性的纤维二糖水解酶的制备方法，其特征在于，将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰胺置换为丙氨酸。

【技术特征摘要】
2014.12.04 JP 2014-2461211.一种提高了活性的纤维二糖水解酶的制备方法，其特征在于，
将作为从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基
酸的天门冬酰胺、或者在与所述纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二
糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天门冬酰胺置换为丙氨
酸。
2.一种提...

【专利技术属性】
技术研发人员：光泽茂信，木村敬一，田中麻衣子，新川智，
申请(专利权)人：本田技研工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP