一种卡那霉素残留的检测方法技术

一种基于适体引发的核酸外切酶III(Exo III)循环酶切的卡那霉素残留的检测方法及其应用，属于分析化学技术领域。本发明专利技术主要是利用巯基自组装的方式，将与卡那霉素适配体(K-aptamer)互补的单链DNA(ssDNA)修饰于金电极表面，加入少量K-aptamer与其配对形成少量双链DNA(dsDNA)。随后加入Exo III，利用可特异性的酶切dsDNA中的ssDNA使得剩余的适配体释放，重新与ssDNA结合形成dsDNA，引发再次酶切，若干循环后使得修饰ssDNA酶切完全。体系存在卡那霉素，通过与适配体的结合抑制循环酶切使ssDNA得以保留，且保留量与卡那霉素的浓度相关。利用电分析方法对ssDNA可静电吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)进行定量实现卡那霉素残留的检测。该方法具有较高灵敏度，可实现牛奶中卡那霉素残留的灵敏测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种基于适体引发的核酸外切酶III(ExoIII)循环酶切的卡那霉素的检测方法，特别是牛奶中卡那霉素残留的检测方法，属于分析化学领域。
技术介绍
卡那霉素是一种用于治疗革兰阴性菌和革兰阳性菌感染的氨基糖苷类广谱抗生素，是临床上最为常用的抗感染药物之一。和其他的氨基糖苷类抗生素一样，卡那霉素在动物性食品中的残留可能会引起食入者过敏，长期食用卡那霉素残留超标食品还可导致耳和肾毒性等毒副作用。欧共体规定牛奶中的卡那霉素最大残留限量为0.15μg/g(约318.5nM)。因此，需要建立针对卡那霉素检测的有效方法从而加强对产品中抗生素残留的监控，以满足实际生产生活的需要。核酸适体是通过体外筛选获得的核酸序列，能够与多种目标物质高效、特异地结合。由于上述优势，核酸适体已经成为了抗体的有效替代，广泛的应用于小分子、蛋白质和细胞的检测。伴随着卡那霉素适体(K-aptamer)的发现，基于适体的卡那霉素检测方法得到了发展。核酸外切酶III(ExoIII)是一种针对双链DNA的平末端3’端进行切割的核酸酶。通过将K-aptamer和ExoIII结合，就可以很方便的实现信号的放大，将其应用于卡那霉素的检测即可实现实际样品中卡那霉素的灵敏检测。现今检测卡那霉素常见技术主要包括有分光光度法，高效液相色谱法，荧光法，酶联免疫法及电化学法等。与其他分析检测方法相比，电化学方法具有的设备简单，价格低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。r>
技术实现思路
本专利技术的目的是将核酸适体、核酸外切酶的循环酶切及电化学检测技术的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，而又具有极高灵敏度并可方便应用于实际样品卡那霉素残留的检测方法。本专利技术的技术方案：本专利技术是一种基于适体引发的核酸外切酶III(ExoIII)循环酶切的卡那霉素残留的检测方法，将金电极表面修饰单链DNA(ssDNA)，加入少量卡那霉素适体(K-aptamer)使之与ssDNA配对结合形成双链DNA(dsDNA)，得到存在少量dsDNA和大量ssDNA的电极修饰界面；加入ExoIII，利用ExoIII可特异性的酶切dsDNA中ssDNA的特性，导致K-aptamer的释放，而释放的K-aptamer又可以重新和电极表面的ssDNA结合形成dsDNA促使ExoIII的再次切割；当体系存在卡那霉素时，卡那霉素与K-aptamer的特异性结合抑制了ExoIII的循环酶切，使得电极表面的ssDNA得以保留且保留量与卡那霉素的浓度成正比；利用ssDNA可吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)，采用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过测定一系列标准浓度卡那霉素的所得到的RuHex峰值大小绘制标准曲线，即可实现实际牛奶样品中卡那霉素残留的灵敏检测。方法包括以下步骤：金电极的预处理、ssDNA的修饰、K-aptamer与电极表面ssDNA的互补配对结合、样品孵育、ExoIII的循环酶切，卡那霉素残留的电化学表征。(1)金电极的预处理用1微米、0.3微米的三氧化二粉末分别对直径为3mm金圆盘电极进行抛光，之后用酒精和超纯水分别超声5分钟。清洗之后将金圆盘电极分别置于水虎鱼(浓硫酸∶H2O2的体积比为3∶1)和50％的硝酸溶液中浸泡5分钟和30分钟。之后将处理好的电极置于0.5MH2SO4中，在0-1.5V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速设置为0.1V/s，直至达到稳定后，用氮气吹干电极界面。(2)ssDNA的修饰用固定溶液(10mMTris，1mMEDTA，0.1MNaCl，10mMTCEP，pH7.4)稀释ssDNA至1μM。将(1)中处理好的金电极置于上述100μL溶液中，室温浸泡12h后，随后用超纯水冲洗，以去除金表面未共价结合的核酸分子。紧接着再将电极浸泡在1mM巯基己醇(MCH)溶液1小时，之后再次用超纯水冲洗。上述ssDNA的序列为：5′-SH-TCGGCTTAGCCTCAACCCCCA-3′。(3)K-aptamer与电极表面ssDNA的互补配对结合用杂交溶液(10mMPBS，0.25MNaCl，pH7.4)稀释K-aptamer至1nM。将(2)中得到的ssDNA修饰的电极浸泡于上述100μL溶液中，之后90℃加热5分钟，再缓慢冷却至室温，使得ssDNA与K-aptamer充分配对结合。上述K-aptamer的序列为：5′-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3′。(4)样品孵育用绑定溶液(10mMPBS，0.1MNaCl，5mMMgCl2，5mMKCl，pH7.4)稀释卡那霉素至不同的浓度的标准液。将(3)中得到的修饰电极浸泡在上述50μL不同浓度的卡那霉素溶液中37℃孵育10分钟。之后用冲洗溶液(20mMTris-HCl，0.1MNaCl，5mMMgCl2，1％Tween-20，pH7.4)冲洗。(5)ExoIII的循环酶切将经过(4)处理得到的电极浸泡在50μL含有1U·μL-1ExoIII(购自NEB)的1×NEB溶液(与ExoIII配套，直接稀释后使用即可)中37℃反应1小时。(6)卡那霉素残留的电化学表征用冲洗溶液充分冲洗经过(5)处理的电极，之后用含有5μMRuHex的10mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.4)扫描电极。本检测采用的电化学工作站(CHI660E)，以饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。使用的扫描手段为方波伏安法，电位设置为-0.56V到-0.1V，扫速0.025V/s。卡那霉素的量越多，被保留的ssDNA也就越多，得到的电信号也就越强。通过绘制标准曲线，计算出样品中卡那霉素的浓度。在1pMto500pM范围内，电信号随着卡那霉素浓度的升高而增加，电信号与浓度存在线性关系。本专利技术的有益效果：①本方法利用K-aptamer对卡那霉素的选择性，结合ExoIII的信号放大和电化学检测方法灵敏、方便的优势，实现了牛奶中卡那霉素的检测，灵敏度极高，对牛奶中卡那霉素的快速、灵敏检测具有重要意义；②在方法学上具有普遍借鉴意义，通过改变体系中的适体序列，就可以设计出多种抗生素残留检测的高灵敏度的分析方法。附图说明图1为基于适体引发的ExoIII循环酶切的卡那霉素残留检测原理图图2为基于适体引发的ExoIII循环酶切的卡那霉素残留检测条件优化图图3为基于适体引发的ExoIII循环酶切的卡那霉素残留检测专一性图图4为不同浓度卡那霉素存在下，电化学信号与卡那霉素的浓度关系图具体实施方式实施例1.基于适体引发的ExoIII循环酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于适体引发的核酸外切酶III(Exo III)循环酶切的卡那霉素残留的检测方法，其特征在于电极表面修饰的单链DNA(ssDNA)与少量卡那霉素适体(K‑aptamer)配对结合形成双链DNA(dsDNA)，得到存在少量dsDNA和大量ssDNA的电极修饰界面；加入核酸外切酶III(Exo III)，利用Exo III特异性的酶切dsDNA中ssDNA的特性，使得dsDNA中ssDNA逐渐水解，与此同时促使与之结合的K‑aptamer释放，释放的K‑aptamer又可以重新和电极表面的ssDNA结合形成dsDNA，促使Exo III循环酶切；当体系存在卡那霉素时，卡那霉素与K‑aptamer可特异性结合，这种结合会抑制Exo III的循环酶切，使得电极表面的ssDNA得以保留且保留量与卡那霉素的浓度相关；利用ssDNA可吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)，采用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现卡那霉素残留的灵敏检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于适体引发的核酸外切酶III(ExoIII)循环酶切的卡那霉素残留的检测方
法，其特征在于电极表面修饰的单链DNA(ssDNA)与少量卡那霉素适体(K-aptamer)配对结
合形成双链DNA(dsDNA)，得到存在少量dsDNA和大量ssDNA的电极修饰界面；加入核酸外切
酶III(ExoIII)，利用ExoIII特异性的酶切dsDNA中ssDNA的特性，使得dsDNA中ssDNA逐渐
水解，与此同时促使与之结合的K-aptamer释放，释放的K-aptamer又可以重新和电极表面
的ssDNA结合形成dsDNA，促使ExoIII循环酶切；当体系存在卡那霉素时，卡那霉素与K-
aptamer可特异性结合，这种结合会抑制ExoIII的循环酶切，使得电极表面的ssDNA得以保
留且保留量与卡那霉素的浓度相关；利用ssDNA可吸附电信号分子六氨合钌(RuHex)，采用
电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现卡那霉素残留
的灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的卡那霉素残留的检测方法，其特征是K-aptamer与ssDNA形成
dsDNA后引发的酶切。经预处理的金电极与100μL1μMssDNA溶液室温孵育12小时后，再将
该电极浸泡于1mM巯基己醇溶液1小时。紧接着再将电极浸泡于100μL1nMK-aptamer溶液
放置于90℃孵育，5分钟后缓慢冷却至室温。
3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：许媛媛，苗晋锋，李夏青，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32