乙酰乳酸合成酶抑制剂抗性相关蛋白UVALS及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乙酰乳酸合成酶抑制剂抗性相关蛋白UVALS及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的UVALS蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明专利技术还保护UVALS蛋白的应用：(c1)调控植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性；(c2)促进植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性增加；(c3)调控微生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性；(c4)促进微生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性增加。本发明专利技术对于培育对乙酰乳酸合成酶抑制剂具有高抗性的植物新品种具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及乙酰乳酸合成酶抑制剂抗性相关蛋白UVALS及其编码基因与应用。
技术介绍
现代生物技术已引起农业中若干领域的重大变革，其中最突出的是将外源基因导入植物体中的表达，给作物育种带来革命性的变化，使人们摆脱了利用传统杂交技术培育新品种的局面，进入自由构建遗传性状的新时代。通过遗传工程培育转基因抗除草剂作物品种是发展最快、研究最深、农民接受程度最高的案例，其中最关键的环节是抗除草剂基因的获得，从突变的抗除草剂植物和微生物体中分离抗性基因是最主要途径。乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂通过抑制植物体内的乙酰乳酸合成酶活性，从而阻止支链氨基酸的合成，导致蛋白质的合成受到破坏，阻碍细胞分裂期的DNA合成，从而使植物细胞的有丝分裂停止在Gl阶段的S期(DNA合成期)和G2阶段的M期，干扰了DNA的合成，细胞因此不能完成有丝分裂，进而使植物停止生长，最终导致植物个体死亡。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供乙酰乳酸合成酶抑制剂抗性相关蛋白UVALS及其编码基因与应用。本专利技术提供的蛋白质，命名为UVALS蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(b)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码UVALS蛋白的基因(UVALS基因)也属于本专利技术的保护范围。UVALS基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有UVALS基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌均属于本专利技术的保护范围。可用现有的表达载体构建含有UVALS基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。使用UVALS基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用UVALS基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。所述重组表达载体具体可为如下重组质粒：在pGBKT7载体的多克隆位点(例如BamHI和SalI酶切位点之间)插入UVALS基因得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为如下重组质粒：在Super1300载体的多克隆位点(例如XbaⅠ和SacⅠ酶切位点之间)插入UVALS基因得到的重组质粒。本专利技术还保护UVALS蛋白的应用，为如下(c1)至(c4)中的至少一种：(c1)调控植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性；(c2)促进植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性增加；(c3)调控微生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性；(c4)促进微生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性增加。所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述微生物可为酵母，具体可为酵母AH109R。本专利技术还保护UVALS基因在培育转基因植物中的应用；所述转基因植物为对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性增加的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。本专利技术还保护一种培育转基因植物的方法，是将UVALS基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性高于所述目的植物。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述UVALS基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。携带有UVALS基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物中。本专利技术还保护一种培育重组微生物的方法，是将UVALS基因导入目的微生物中，得到重组微生物；所述重组微生物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性高于所述目的微生物。所述UVALS基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发微生物。所述微生物可为酵母，具体可为酵母AH109R。本专利技术还保护UVALS蛋白或UVALS基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述育种的目的为培育对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性增高的植物。所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。以上任一所述乙酰乳酸合成酶抑制剂具体可为氯嘧磺隆。本专利技术还保护UVALS蛋白作为乙酰乳酸合成酶的应用。本专利技术发现了一个对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性显著高于现有蛋白的蛋白突变体，对于培育对于乙酰乳酸合成酶抑制剂具有高抗性的植物新品种或重组微生物具有很高的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的氯嘧磺隆为98％氯嘧磺隆原药，由大连瑞泽农药股份有限公司生产。实施例1、UVALS蛋白以及UVALS基因的发现一、最佳诱变时间的确定1、将黑曲霉TR-H转接到PDA斜面培养基上，28℃培养3-5d。2、用无菌生理盐水洗下斜面上的黑曲霉孢子，倒入已灭菌的装有20～30颗直径4～5mm的玻璃珠的三角瓶中，220rpm振荡培养1h，使孢子分散充分，然后用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性相关蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c4)中的至少一...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶波，乔禹欣，马诚义，邵百惠，张洪岩，宋秀丽，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23