一株低毒力重组猪脑心肌炎病毒及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物动物疫苗技术领域，尤其涉及一株低毒力猪源脑心肌炎病毒,将猪脑心肌炎病毒毒株的全长cDNA置于CMV启动子控制下，采用DNA转染系统拯救病毒，获得重组病毒，方法简便易行，成功建立该病毒cDNA感染性克隆，拯救获得病毒，体外复制特性与原始病毒相似，但对小鼠致病性明显减弱，为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础；本申请得到的低毒力猪源脑心肌炎病毒经灭活后制备成疫苗，保护率高达90%，是一种安全且保护率高的灭活疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物动物疫苗
，尤其涉及一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒,还涉及所述低毒力重组猪源脑心肌炎病毒的应用。
技术介绍
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus，EMCV)属于微RNA病毒科(Picornaviridae)成员。EMCV对啮齿类、猪、老虎、牛、大象、以及人在内的多种灵长类动物，致病性差异较大。某些EMCV分离株感染仔猪可引发急性致死性心肌炎，而感染母猪则会导致流产、死胎等繁殖障碍。该病毒已成世界性分布，阻碍了养殖业的发展，也对人类的健康造成影响。目前，全世界大概有40个毒株，从2005年至今，我国已分离到大约15个EMCV毒株，为该病毒深入研究提供丰富的材料。EMCV为单股正链RNA病毒，全长为7.8kb，包括5’UTR、3’UTR和中间一个较大的开放阅读框(ORF)。该阅读框编码11个蛋白，包括4个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4和7个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及L蛋白。其中VP1的变异性最大，是EMCV重要的保护性抗原。随着RNA病毒全长cDNA感染性克隆技术的建立，研究者可以有效体外转录出感染性RNA，以拯救RNA病毒。目前，RNA病毒拯救系统至少有4种。先前报道的EMCV感染性克隆的构建都是将全长病毒的cDNA置于T7/SP6启动子的控制下，利用外源T7/SP6RNA聚合酶在体外转录RNA基因组，再转染易感细胞来拯救病毒，也有相关技术申请过专利。已有文献报道可以将体外转录过程转移到细胞体内进行，将病毒全长cDNA置于真核启动子CMV控制下，利用细胞内的RNA聚合酶I和RNA聚合酶II转录成RNA拯救病毒，该种方法产生的病毒量大约是前者的100倍。现有技术中，还没有使用此种方法拯救猪脑心肌炎病毒的报道。
技术实现思路
为了解决以上RNA病毒拯救中拯救猪脑心肌炎病毒方法方面存在的空白，本申请公开了一株低毒力猪源脑心肌炎病毒。本申请还公开了上述一株低毒力猪源脑心肌炎病毒的应用。本申请是通过以下措施实现的：一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒，是通过以下步骤构建得到的：(1)提取猪源脑心肌炎病毒株总RNA，RT-PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下AF5-GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC-3AR5-TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG-3B1F5-GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG-3B1R5-CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT-3B2F5-GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG-3B2R5-TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG-3CR15-TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT-3CR25-CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT-3以猪源脑心肌炎病毒总RNA作为模板，以AR、B1R、B2R、以及CR1为特异性下游引物，构建反应体系获得的A、B1、B2、C片段的cDNA，分别以AF/AR，B1F/B1R，B2F/B2R，CF/CR2为引物，相应的cDNA为模板进行PCR反应，获得A、B1、B2、C四个片段，然后利用B1F/B2R为引物，将B1和B2片段进行融合反应，获得B片段；(2)将A、B、C片段分别与pEasy-simpleBlunt克隆载体进行连接，转化感受态细胞，培养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒pEasy-A、pEasy-B和pEasy-C；(3)利用双酶切的方法将C、B、A片段依次克隆至载体中，构建病毒全长cDNA克隆，得重组质粒pCMV-NJ08；(4)将重组质粒pCMV-NJ08转染BHK-21细胞，经过培养得到猪源脑心肌炎病毒株感染性克隆rNJ08。所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选rNJ08接种BHK-21细胞，连续传代，第3、5、10代拯救病毒的TCID50为107.66～108.5TCID50/mL。所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选步骤(3)中利用双酶切的方法将C、B、A片段依次克隆至载体中步骤如下：pEasy-C质粒用PacI和SpeI双酶切，构建连接体系利用T4连接酶将片段C克隆至用同样酶切处理的的载体CMV-β，22℃连接5h，转化Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性质粒命名为pCMV-C；然后pEasy-B质粒经PacI和XhoI双酶切，将酶切纯化后的B片段与PacI和XhoI双酶切后的pCMV-C载体连接，获得阳性质粒命名为pCMV-BC；pEasy-A质粒用PacI和NheI双酶切，酶切纯化后的A片段与PacI和NheI双酶切后的pCMV-BC载体连接，将A片段连入pCMV-BC载体中，获得阳性质粒命名为pCMV-NJ08。所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选第6243位的T变成A，作为感染性克隆的遗传标记。所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，优选猪源脑心肌炎病毒为猪脑心肌炎病毒NJ08株。所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒在病毒拯救、病毒致弱机理及利用该病毒的cDNA感染性克隆为载体插入不同病毒保护抗原基因、构建不同病毒的嵌合病毒来表达外源蛋白以及由此开发出单价、双价或多价疫苗中的应用。将灭活的低毒力猪源脑心肌炎病毒使用ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫苗。ISA15A佐剂与抗原体积比为1:4，ISA206佐剂与抗原体积比为1:1。所述的应用，优选使用BEI浓度0.002mol/L、28℃作用24h进行灭活。本研究采用体内转录的方法成功构建了EMCV反向遗传操作系统，拯救获得低毒力重组病毒株rNJ08。将重组病毒进行灭活处理，加入ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫苗，接种小鼠后，均能有效地刺激机体产生较好的免疫反应，并能产生中和抗体。ISA15A和ISA206佐剂对EMCV灭活抗原具有较好的佐剂作用，研制的EMCV灭活疫苗小鼠免疫保护率分别为80％和100％。为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。本专利技术的有益效果：1、本申请克服现有技术的不足，首次将猪脑心肌炎病毒NJ08毒株的全长cDNA置于CMV启动子控制下，采用DNA转染系统拯救病毒，获得重组病毒，方法简便易行，转染效率也大大提高并且更加稳定，产生的病毒量大；2、本申请采用DNA转染系统，获得猪源EMCVNJ08毒株的重组病毒，成功建立该病毒cDNA感染性克隆，拯救获得病毒，体外复制特性与原始病毒相似，但对小鼠致病性明显减弱，为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础；3、本申请得到的低毒力猪源脑心肌炎病毒经灭活后制备成疫苗，保护率达到90％以上，是一种安全且保护率高的灭活疫苗。附图说明图1为EMCVNJ08株基因组全长cDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒，是通过以下步骤构建得到的：（1）提取猪源脑心肌炎病毒株总RNA，RT‑PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下AF5‑GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC‑3 AR5‑TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG‑3B1F5‑GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG‑3B1R5‑CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT‑3B2F5‑GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG‑3B2R5‑TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG‑3CR15‑ TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT‑3CR25‑CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT‑3以猪源脑心肌炎病毒总RNA作为模板，以AR、B1R、B2R、以及CR1为特异性下游引物，构建反应体系获得的A、B1、B2、C片段的cDNA，分别以AF/AR，B1F/B1R，B2F/B2R，CF/CR2为引物，相应的cDNA为模板进行PCR反应，获得A、B1、B2、C四个片段，然后利用B1F/B2R为引物，将B1和B2片段进行融合反应，获得B片段；（2）将A、B、C片段分别与pEasy‑simple Blunt 克隆载体进行连接，转化感受态细胞，培养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒pEasy‑A、pEasy‑B和pEasy‑C；（3）利用双酶切的方法将C 、B、A片段依次克隆至载体中，构建病毒全长cDNA克隆，得重组质粒pCMV‑NJ08；（4）将重组质粒pCMV‑NJ08转染BHK‑21细胞，经过培养得到猪源脑心肌炎病毒株感染性克隆rNJ08。...

【技术特征摘要】
1.一株低毒力重组猪源脑心肌炎病毒，是通过以下步骤构建得到的：
（1）提取猪源脑心肌炎病毒株总RNA，RT-PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下
AF5-GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC-3AR5-TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG-3B1F5-GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG-3B1R5-CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT-3B2F5-GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG-3B2R5-TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG-3CR15-TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT-3CR25-CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT-3以猪源脑心肌炎病毒总RNA作为模板，以AR、B1R、B2R、以及CR1为特异性下游引物，构建反应体系获得的A、B1、B2、C片段的cDNA，分别以AF/AR，B1F/B1R，B2F/B2R，CF/CR2为引物，相应的cDNA为模板进行PCR反应，获得A、B1、B2、C四个片段，然后利用B1F/B2R为引物，将B1和B2片段进行融合反应，获得B片段；
（2）将A、B、C片段分别与pEasy-simpleBlunt克隆载体进行连接，转化感受态细胞，培养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒pEasy-A、pEasy-B和pEasy-C；
（3）利用双酶切的方法将C、B、A片段依次克隆至载体中，构建病毒全长cDNA克隆，
得重组质粒pCMV-NJ08；
（4）将重组质粒pCMV-NJ08转染BHK-21细胞，经过培养得到猪源脑心肌炎病毒株感染性克隆rNJ08。
2.根据权利要求1所述的低毒力猪源脑心肌炎病毒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：白娟，方谱县，姜平，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32