分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法技术

本发明专利技术提供一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，采用无菌培养结合同位素示踪技术，研究环境因素对植物生长及氨基酸吸收的影响，确定环境因素的长期效应，之后采用短期吸收及添加代谢抑制剂的方法，研究环境因素对根系短期吸收氨基酸及吸收方式的影响，最后采用同位素示踪结合气相色谱-同位素质谱联用检测技术，确定环境因素限制甘氨酸代谢的限速步骤。本发明专利技术方法设计合理，操作简单，采用的同位素示踪技术及气相色谱-同位素质谱联用检测技术精密度和可信度较高，可有效的分析环境因素影响氨基酸营养贡献的机理。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于土壤科学领域，涉及植物营养学及植物生理学研究方法，尤其涉及一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法。
技术介绍
自从1840年李比希(Liebig)创立了“植物矿质营养学说”起，大多数的研究都针对无机氮展开，而有机营养的研究而相对落后。近十年的研究表明，大多数植物具备吸收氨基酸、多肽、核酸，甚至大分子蛋白质的能力。尽管植物可以吸收有机氮已经成为共识，但自然环境下土壤氨基酸周转迅速，因此自然环境下氨基酸的营养贡献仍没有定论。Lipson等根据植物-微生物竞争吸收的模型，计算出氨基酸对高山植物的营养贡献率不低于50％。然而，在亚热带地区，根据13C,15N双标记技术研究得出其营养贡献率低于1％。从不同地区氨基酸营养贡献的差异可以看出，环境条件对氨基酸营养贡献具有重要的作用。环境因子包括温度、光照强度、二氧化碳浓度、土壤氮素组成及含量、土壤酸度、土壤结构、土壤污染物组成及浓度等，这些因子会对氨基酸营养贡献产生较大的影响。这些因素不止影响土壤中氨基酸的生物有效性，还会对植物根系吸收、根系到地上部的转运、根系及地上部氨基酸的代谢等产生较大的影响。然而，关于该方面的研究及研究方法相对缺乏，缺少系统准确的测定影响作用的方法，尤其是从植物营养和植物生理角度综合分析环境因素对氨基酸营养代谢的影响。
技术实现思路
本专利技术旨在解决研究环境因素对氨基酸吸收代谢影响方法缺乏的问题，提供一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，是一种采用同位素示踪技术及气相色谱-同位素质谱联用技术，分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法。本专利技术方法通过以下步骤实现：1.环境因子对氨基酸长期吸收的影响采用无菌营养液培养方法：以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生长状态一致的植物，更换为3mM5-55％15N-甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO2浓度等，每2-3d更换一次营养液，培养6-25d后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，根系于清水中清洗三次，接着放置于超声波清洗机中清洗1分钟，采用0.5M氯化钙溶液清洗三次，最后用纯净水冲洗三次，以去除吸附于根系上的15N，采用冷冻干燥或者烘箱烘干后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根据此步骤可以分析环境因素对植物生长及氨基酸吸收的长期影响；2.环境因子对氨基酸短期吸收及吸收方式的影响采用如步骤1所述的培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水多次冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8-10h，之后将其根系放置于50μmolL-1CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后以不用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM98.10at.％15N-甘氨酸的营养液中，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，进行标记氨基酸的短期吸收及吸收方式试验，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO2浓度等，培养2-6h后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，根系放于清水中清洗三次，接着放置于超声波清洗机中清洗1分钟，采用0.5M氯化钙溶液清洗三次，最后用纯净水冲洗三次，以去除吸附于根系上的15N，采用冷冻干燥或者烘箱烘干后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根据步骤1的结果，可以确定环境因子对甘氨酸吸收的长期效应，即对吸收和后续代谢的影响，而根据步骤2的短期吸收结果，可以分析环境因素对根系吸收及吸收方式的影响，进而推测影响甘氨酸营养贡献的限速步骤。3.环境因子对氨基酸在植物体内代谢的影响采用步骤1所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水多次冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8-24h，之后更换为3mM50-99.8％15N-甘氨酸为氮源，，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO2浓度等，培养10-24h后破坏性采样，将植物根系于清水中清洗三次，接着放置于超声波清洗机中清洗1分钟，采用0.5M氯化钙溶液清洗三次，最后用纯净水冲洗三次，以去除吸附于根系上的15N，采用冷冻干燥或者烘箱烘干后，将根系和植物地上部一起放于球磨仪中粉碎；称取20mg经干燥后粉碎的植物样品，加4ml80％乙醇放置于震荡机中以10-30r/min震荡提取1h，提取液在3500-4500g/min离心15min，保留上清液，残渣用1ml80％乙醇再提取1h，10000-12000g离心5-15min，两次离心的上清液混合，采用N2吹干或者低温低压旋转蒸发仪于25-35℃下蒸干，再次用2ml0.1mol/LHCl溶解，在10000-15000r/min转速下离心10-15min，上清液倾倒于体积为2cm3的阳离子交换柱中(Dowex50WX8-200)，该阳离子交换柱采用20ml超纯水清洗，其中的氨基酸采用20ml4mol/LNH4OH洗脱，洗脱液氮吹过夜，去除其中的NH3，之后冷冻干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就转变为相应的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸浓度及15N丰度采用气相色谱-同位素质谱联用仪进行检测(GasChromatographyMassSpectrometry)。采用步骤1可以研究环境因素对植物长期吸收的影响，而步骤2主要研究环境因素对植物根系吸收能力的影响，步骤3主要研究环境因素对植物体内氨基酸代谢的影响，结合三方面结果，就可以综合评价环境因素对植物吸收利用氨基酸的影响，并解释具体的代谢限速步骤。本专利技术通过采用无菌培养结合同位素示踪技术，研究环境因素对植物生长及氨基酸吸收的影响，确定环境因素的长期效应，之后采用短期吸收及添加代谢抑制剂的方法，研究环境因素对根系短期吸收氨基酸及吸收方式的影响，最后采用同位素示踪结合气相色谱-同位素质谱联用检测技术，确定环境因素限制甘氨酸代谢的限速步骤。该方法操作简单，采用的同位素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)环境因子对氨基酸长期吸收的影响采用无菌营养液培养方法：以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15‑25d后，选择生长状态一致的植物，更换为3mM 5‑55％15N‑甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置光照强度、营养液pH、CO2浓度相应的环境条件，每2‑3d更换一次营养液，培养6‑25d后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，去除吸附于根系上的15N，清洗根系，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，干燥后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析环境因素对植物生长及氨基酸吸收的长期影响；(2)环境因子对氨基酸短期吸收及吸收方式的影响采用步骤(1)所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15‑25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8‑10h，之后将其根系放置于50μmol L‑1CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后以不用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM 98.10at.％15N‑甘氨酸的营养液中，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，进行标记氨基酸的短期吸收及吸收方式试验，设置光照强度、营养液pH、CO2浓度相应的环境条件，培养2‑6h后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，根系放于清水中清洗，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，以去除吸附于根系上的15N，干燥后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析环境因素对根系吸收及吸收方式的影响，进而分析影响甘氨酸营养贡献的限速步骤；(3)环境因子对氨基酸在植物体内代谢的影响采用步骤(1)所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15‑25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8‑24h，之后更换为3mM 50‑99.8％15N‑甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO2浓度等，培养10‑24h后破坏性采样，将植物根系于清水中清洗，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，以去除吸附于根系上的15N，干燥后，将根系和植物地上部一起放于球磨仪中粉碎；称取20mg经干燥后粉碎的植物样品，加4ml 80％乙醇放置于震荡机中以10‑30r/min震荡提取1h，提取液在3500‑4500g/min离心15min，保留上清液，残渣用1ml 80％乙醇再提取1h，10000‑12000g离心5‑15min，两次离心的上清液混合，采用N2吹干或者低温低压旋转蒸发仪于25‑35℃下蒸干，再次用2ml 0.1mol/L HCl溶解，在10000‑15000r/min转速下离心10‑15min，上清液倾倒于体积为2cm3的阳离子交换柱中，该阳离子交换柱采用20ml超纯水清洗，其中的氨基酸采用20ml 4mol/LNH4OH洗脱，洗脱液氮吹过夜，去除其中的NH3，之后冷冻干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就转变为相应的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸浓度及15N丰度采用气相色谱‑同位素质谱联用仪进行测定。...

【技术特征摘要】
1.一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)环境因子对氨基酸长期吸收的影响
采用无菌营养液培养方法：以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液
中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生
长状态一致的植物，更换为3mM5-55％15N-甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格
兰营养液配方，设置光照强度、营养液pH、CO2浓度相应的环境条件，每2-3d更换一次营养
液，培养6-25d后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，去除吸附于根系上的15N，清洗根
系，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶液清洗，最后用纯净水冲洗，干燥
后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植
物氮素含量及甘氨酸吸收量，分析环境因素对植物生长及氨基酸吸收的长期影响；
(2)环境因子对氨基酸短期吸收及吸收方式的影响
采用步骤(1)所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸
为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物
15-25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水冲洗根系及离心管后，将植物放置于
清水中8-10h，之后将其根系放置于50μmolL-1CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后以不
用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM98.10at.％15N-甘氨酸的营养液中，营养液
中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，进行标记氨基酸的短期吸收及吸收方式试验，
设置光照强度、营养液pH、CO2浓度相应的环境条件，培养2-6h后破坏性采样，将植物根系
与地上部分开，根系放于清水中清洗，接着放置于超声波清洗机中清洗，再用0.5M氯化钙溶
液清洗，最后用纯净水冲洗，以去除吸附于根系上的15N，干燥后，将根系和地上部一起放于
球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，
分析环境因素对根系吸收及吸收方式的影响，进而分析影...

【专利技术属性】
技术研发人员：马庆旭，吴良欢，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33