多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法，所述方法在多交叉置换扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记生物素，在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，所述方法针对单增李斯特菌lmo0733的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种单增李斯特菌检测方法，属于微生物学领域。
技术介绍
单增李斯特菌(Listeriamonocytogens，LM)是一种革兰阳性的短杆菌，有运动能力、兼性胞内寄生菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，是重要的食源性人兽共患病原菌，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌能够引起人类严重感染。李斯特菌病的易感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病主要临床症状为败血症、脑膜炎、孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障。单增李斯特菌病在人类的感染率不高，但该病的死亡率极高而受到广泛的关注，一度成为欧美国家重大公共卫生问题。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的报道，实际存在与否不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗、开展单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯特菌检测方法成为必要。目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括两次增菌、选择培养及后续的生化鉴定，其劣势耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于单增李斯特菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断单增李斯特菌的PCR方法和Real-timePCR方法，所选择的目的基因(如hly，prfA，iap)特异性差，极易出现假阳性扩增。此外这些检测技术的灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，食源性病原体监测以及单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的诊断方法，能够快捷、敏感、特异的鉴定单增李斯特菌成为必要。为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增、便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，在生物、农业、医学等领域，专利技术人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(MultipleCrossDisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。在本专利技术中，为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济，专利技术人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiplecrossdisplacementamplificationcoupledwithgoldnanoparticle-basedlateralflowbiosensor，MCDA-LFB)，并将该技术运用于单增李斯特菌的检测。本专利技术针对单增李斯特菌的特异基因lmo0733设计一套MCDA扩增引物，旨在验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对单增李斯特菌病原体的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1，含有序列R1的扩增引物R1，含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；(4)在链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。在一个优选的技术方案中，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为地高辛。更为优选地，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*5’端标记地高辛。在一个更为优选的技术方案中，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗地高辛抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在60-63℃的环境中进行的。在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61℃的环境中进行的。在一个优选的技术方案中，所述目的基因为单增李斯特菌的lmo0733。优选地，所述置换引物F1的序列如SEQIDNO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQIDNO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQIDNO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQIDNO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQIDNO:5所示，引物C1的序列如SEQIDNO:6所示，在所述引物C1的5’端标记有地高辛的引物C1*的序列如SEQIDNO:7所示，引物C2的序列如SEQIDNO:8所示，引物D1的序列如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1，含有序列R1的扩增引物R1，含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；(4)在链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。...

【技术特征摘要】
1.一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1，含有序列R1的扩增引物R1，含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；(4)在链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为地高辛。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*5’端标记地高辛。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶长芸，王毅，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11