本发明专利技术公开了一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，与现有技术相比，本发明专利技术通过甲基化的DNA修饰到电极上，从而使耦联了二茂铁-抗甲基化抗体修饰到电极上，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。本发明专利技术提供的检测方法对DNA转甲基酶的检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，可以实现对DNA甲基转移酶活性的灵敏检测。
技术介绍
肿瘤表观遗传学是一门新兴的学科,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质修饰、基因组印记和非编码RNA调控等几个方面。其中,DNA甲基化与肿瘤的关系是研究的热点。近年来，诸多研究表明DNA甲基化在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，DNA甲基化受到越来越多的关注。对于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，大致可以分为两类：一类是从DNA甲基转移酶的角度，另一类是从DNA甲基化水平的角度进行研究；后者又分为总体DNA甲基化水平和特异基因序列DNA甲基化水平的检测。已有研究表明，胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键，其与印迹的清除和重建、x染色体的失活、种系分化等等都有密切关系。经过近半个世纪的研究，DNA甲基化水平的变化目前已是人类癌症的一种典型改变，并伴随着恶性肿瘤细胞的产生、发展而变化。因此，快速有效的检测DNA甲基化水平的变化对肿瘤的诊断、发生、发展都至关重要。目前检测DNA甲基化的方法费力，费时，灵敏度低和不够精确。因此，探讨甲基化形成与改变的可能机制，建立准确性好，灵敏度高，操作简单的DNA甲基化检测方法意义重大。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，甲基化后的发夹DNA1与电极上的发夹DNA2形成双链，发夹DNA2上修饰的亚甲蓝分子远离电极表面，加入二茂铁-抗甲基化抗体后修饰到发夹DNA1上的甲基化位点，从而构建了一个信号转换的电化学生物传感器，通过甲基化前后检测到的信号转换检测DNA甲基转移酶活性，实现了对DNA甲基转移酶的灵敏性、特异性、稳定性的检测。本专利技术提供的一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)制备二茂铁-抗甲基化抗体；(2)制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；(3)将发夹DNA1甲基化；(4)制备发夹DNA2修饰的金电极；(5)构建得到电化学生物传感器。步骤(1)包括以下步骤：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡1～2小时，将得到的产物重新分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反应，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。进一步的，步骤(1)具体为：将0.03834g20mM的碳二亚胺和0.03702g32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的10mL0.1M的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，,在室温下震荡1～2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有10μL10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mLPBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。步骤(2)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到发夹DNA1缓冲溶液和发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；进一步的，步骤(2)中发夹DNA1序列为:5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATACCCGG-3′；发夹DNA2序列为:5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’。进一步的，步骤(2)具体为：将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1MpH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为100μM的发夹DNA1缓冲溶液和浓度为100μM发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；步骤(3)为：将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化；进一步的，步骤(3)具体为：将1μL100μM的发夹DNA1缓冲溶液加入到200μL缓冲溶液里，得0.5μM发夹DNA1缓冲溶液，加入到含有160μMS-腺苷基甲硫氨酸和200μLM.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃湿润条件下反应2小时，之后，用10mM的Tris–HCl(pH＝7.4)清洗3次，发夹DNA1实现甲基化。步骤(4)包括以下步骤：将发夹DNA2缓冲溶液滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应，超纯水清洗后，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有6-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲溶液中，以封闭剩余的空穴；得到发夹DNA2修饰的金电极。步骤(4)具体为：在100μL的100μM发夹DNA2溶液中加入0.1μL的100mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应1小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用PBS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μM，将5μL0.5μM的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM6-巯基乙醇的10mMTris-HCl(pH＝7.4)以封闭剩余的空穴。所述抛光处理具体为：金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。步骤(5)为：将甲基化的发夹DNA1滴加到发夹DNA2修饰的金电极上，室温下培养后得到修饰的金电极，将步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面，室温下培养，清洗，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。进一步的，步骤(5)具体为：将5μL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤(1)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤：a、制备二茂铁-抗甲基化抗体；b、制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；c、将发夹DNA1甲基化；d、制备发夹DNA2修饰的金电极；e、构建电化学生物传感器，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测检测DNA甲基转移酶活性。步骤a具体为：将0.03834g20mM的碳二亚胺和0.03702g32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的10mL0.1M的PBS缓冲溶液(pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)制备二茂铁‑抗甲基化抗体；(2)制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；(3)将发夹DNA1甲基化；(4)制备发夹DNA2修饰的金电极；(5)构建得到电化学生物传感器。
【技术特征摘要】
1.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法
包括以下步骤：
(1)制备二茂铁-抗甲基化抗体；
(2)制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；
(3)将发夹DNA1甲基化；
(4)制备发夹DNA2修饰的金电极；
(5)构建得到电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以
下步骤：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的
PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡1～2小时，将得到的产物重新
分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反
应，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中
发夹DNA1序列为:5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATA
CCCGG-3′；发夹DNA2序列为:
5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTCTACCCGG-MB-3’。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中
将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI甲基转移酶存
储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)包
括以下步骤：将发夹DNA2缓冲溶液滴加到干净的金电极表面，在黑
暗环境下室温反应，超纯水清洗后，再将发夹DNA2修饰的金电极保
存在含有6-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲溶液中，以封闭剩余的空穴；
得到发夹DNA2修饰的金电极。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(...
【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，洪璐，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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