一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉内生真菌中分离获得，属于毛霉属易脆毛霉种(Mucor fragilis)NSY-1株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。

Fungus strain with function of inhibiting acetylcholinesterase and application thereof

The invention discloses a fungal strain inhibiting acetylcholinesterase function, the strains from wild h.serrata endophytic fungi isolated, Mucor species belong to brittle Mucor (Mucor fragilis) NSY-1 strains with genetic stability after 15 generations in the laboratory, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:1. The invention has the function of inhibiting acetylcholinesterase of fungal strains, as biological strains in the treatment of Alzheimer's disease, the excellent production of huperzine a high expression gene into other strains, obtain more excellent traits by genetic modification, in addition to further optimize the strains by mutation breeding. It will be of great significance for the study of the biosynthesis of huperzine A, the protection of plant resources, the improvement of the demand of first-line drugs, and the reduction of the cost of treating Alzheimer's disease.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，具体涉及一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，本专利技术还涉及该真菌菌株的应用。
技术介绍
目前乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在阿尔茨海默病药物市场上处于主导地位。石杉碱甲为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱，是一种强效的可逆性的胆碱酯酶抑制剂，具有多靶点作用，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍，而且外周不良反应低，是治疗阿尔茨海默病临床优选药物之一。源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力，植物提取获得石杉碱甲为最简便方式，但植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈；化学合成生产石杉碱甲仍是研发重要途径之一，但合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物。因此利用从野生蛇足石杉内生真菌中筛选分离具有产石杉碱甲能力的菌株对于治疗阿尔茨海默病和保护植物资源意义重大。虽然目前国内外已有对产石杉碱甲菌株进行开发和研究，但易脆毛霉菌(Mucorfragilis)具备产石杉碱甲功能却鲜有报道。对已获得的易脆毛霉菌(Mucorfragilis)NSY-1株可通过生物技术改造菌株为获得石杉碱甲工业化生产提供新的菌种资源。同时，通过对其菌株产石杉碱甲机理的研究，构建新的转基因生物，使其获得更优良稳定的产石杉碱甲性状和能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，解决植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈；及化学合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物的问题。本专利技术的另一个目的是提供一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株的应用。本专利技术所采用的技术方案是，一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperziaserrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于毛霉属易脆毛霉种(Mucorfragilis)NSY-1株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的特点还在于，该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：(1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；(2)培养条件：26℃，220r/min；(3)装液量：250ml锥形瓶，装液量为100ml；(4)培养时间：7天。该真菌菌株高效稳定性表达石杉碱甲时，该菌株的实验室保存条件为：(1)菌株每次在PDA固体斜面传代后，生长时间为84h；(2)保存菌种条件为4℃，12h后在将其放置-25℃冰箱中进行保存。本专利技术所采用的另一个技术方案是，一种高效表达石杉碱甲并作为治疗阿尔茨海默病的功能菌株在生物合成制药方面的应用。本专利技术所采用的第三个技术方案是，一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株的应用，通过转基因、诱变育种对真菌菌株进行基因改造，以获得表达效率更高、遗传稳定性更好的系列菌株；但基因改造的技术手段并不限于此，也可以采用其他的生物技术进行基因改造方面的应用。本专利技术的有益效果是，本专利技术具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，易脆毛霉菌(Mucorfragilis)NSY-1株，可以作为治疗阿尔茨海默病的生物菌株，将其优良的产石杉碱甲高效表达基因转入其他模式菌株中，通过基因改造获得更多的优良性状，此外还可通过诱变育种达到菌株的进一步优化。对其研究将会为生物合成工业化生产石杉碱甲，保护植物资源、解决临床一线用药需求、降低治疗阿尔茨海默病医药费用有着巨大意义。附图说明图1是本专利技术具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株产石杉碱甲能力与标准品高效液相检测对照图，图中，a为石杉碱甲标准品高效液相色谱，b为本专利技术菌株高效液相色谱；图2为琼脂糖凝胶电泳检测NSY-1菌株中所抽提DNA的PCR产物电泳图。图中，A为电泳PCR产物结果，其中A图中第一条带和第二条带为菌株NSY-1检测区，第三条带为Marker检测区；B为Marker大小标示图；图3为本专利技术具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株光学显微镜图，图中，A为光学显微镜下菌丝形态图，B为光学显微镜下孢子梗和顶囊形态图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperziaserrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于毛霉属易脆毛霉种(Mucorfragilis)NSY-1株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQIDNO：1所示。该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中心保藏。生物材料保藏信息：名称：易脆毛霉(Mucorfragilis)NSY-1株保藏编号：CGMCCNo.12075保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏时间：2016年01月15日地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(一)本专利技术具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株的分离方法如下：将新鲜蛇足石杉植株用自来水冲洗后，先用75％酒精进行表面消毒30s，无菌水冲洗4次，接着用10％NaClO浸泡5min，无菌水冲洗4次，最后再用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗4次后，用无菌刀片将茎切成0.5cm大小，叶片切成0.3cm×0.3cm小块，接种到含有15μg/ml链霉素和1mg/ml脱氧胆酸钠的PDA固体培养基上，倒置于28℃培养箱中进行暗培养。为了检验上述表面消毒是否彻底，同时把在消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌水涂布在培养基上进行培养。2～3d后，无菌操作法挑取在茎段和叶片切口上所长出的菌丝，平板划线法转接到新鲜的PDA平板上，重复上述操作直到得到纯化的内生真菌为止。(二)具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株发酵液制备：将分离得到的纯化内生菌分别接入装有100mlPDA培养基的250ml锥形瓶(每个菌株接3瓶)，置于摇床上，26℃、220r/min振荡培养7d。设置3个重复。内生真菌在振荡培养7d后，发酵液于10000r/min离心15min。(三)具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株产物分析测定取发酵液离心后的上清液50ml，采用氯仿和乙醚提取方法提取石杉碱甲，用甲醇定容到5ml，用高效液相法测定发酵上清液产石杉碱甲的含量。高效液相(HPLC)色谱柱为AgilentCl8柱(4.60mm×250mm，5μm)；色谱条件为:流动相为甲醇-0.1％甲酸(75：25)；流量1.0ml/min；柱温25℃，进样量20μl；检测波长310nm。以石杉碱甲标准品作对照。精密称取石杉碱甲标准品20mg，溶于20mL蒸馏水中，再依次制备成0.05，0.025，0.0125，0.006，0.003mg/ml质量浓度，分别进样20μl。每次5次重复，以确定精密度良好。以峰面积与对应石杉碱甲标准品质量绘制标准曲线，得线性回归方程。通过线性回归方程计算分离获得产石杉碱甲菌株代谢产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，其特征在于，该菌株为从野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，属于毛霉属易脆毛霉种(Mucor fragilis)NSY‑1株，在实验室传代15代后具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，其特征在于，该菌株为
从野生蛇足石杉(Huperziaserrata石杉科，石杉属)内生真菌中分离获得，
属于毛霉属易脆毛霉种(Mucorfragilis)NSY-1株，在实验室传代15代后
具有遗传稳定性，其氨基序列如SEQIDNO：1所示。
2.根据权利要求1所述的具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株，其特
征在于，该真菌菌株高效表达石杉碱甲培养条件为：
(1)培养基：采用PDA液体培养基，具体配方为：马铃薯300g，葡
萄糖20g，蒸馏水1000ml；
(2)培养条件：26℃，220r/min；
(3)装液量：250ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文霞，李伟泽，韩忠文，贾敏，张寒，孙静，刘蓓，周永强，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61