猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法技术

技术编号:14889778 阅读:142 留言:0更新日期:2017-03-28 20:47
本发明专利技术公开了一种猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其包括以下步骤:步骤一,预处理:取新鲜猪脑制得脱脂脑蛋白粉备用;步骤二、超声波处理猪脑蛋白粉:取脱脂脑蛋白粉按照体积比为1:200的比例加入去离子水,使脑蛋白粉完全溶解;逆流脉冲超声波处理:将冷却至室温的脑蛋白粉置于逆流脉冲超声波处理器中处理,其中,超声频率为20kHz,功率为60‑100W,超声4‑6min,期间超声时间2s,间歇时间2s;步骤三,酶解提取粗猪脑多肽,制得猪脑多肽粗提液;步骤四,分离采用截留分子量为3‑5kDa的超滤膜进行分级分离;步骤五,纯化:利用DEAE‑52纤维树脂层析柱对步骤四制备的猪脑多肽进行二次纯化;制得猪脑蛋白抗氧化肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白制备方法。更具体地说,本专利技术涉及一种猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法
技术介绍
猪的各个部位都具有重要的营养价值。尤其是猪脑不仅肉质细腻,鲜嫩可口,富含脑磷脂和蛋白质,而且钙、磷、铁的含量高于猪肉,可增加机体的免疫力,促进新陈代谢和健脑功能。脑组织营养丰富,含有丰富的蛋白质,近年来,研究者从动物脑组织中分离蛋白质,酶法酶解成含游离的氨基酸和低分子肽的酶解物,用其治疗脑方面的疾病。奥地利依比威药厂(Ebewe)制造的脑活素注射液是临床应用最广泛的脑蛋白酶解物产品,它是由猪脑蛋白经酶法酶解后进一步提取制得的药物制剂,其组成为75%的游离氨基酸和25%的小分子肽,研究表明脑活素的生物活性与其含有的小分子肽类密切相关,目前对猪脑蛋白及多肽的相关研究较少,因此研究动物脑组织酶解物中小分子肽的制备方法、分离纯化及其生物活性对社会发展具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其利用超声辅助酶碱提,快速高效地提取制备猪脑蛋白抗氧化肽;其操作简单,处理时间短,蛋白得率高。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点,提供了一种猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其包括以下步骤:步骤一,预处理:取新鲜猪脑冲洗,切碎,经过脱脂、干燥并研磨成粉,制得脱脂脑蛋白粉备用;步骤二、超声波处理猪脑蛋白粉:取步骤一制得的脱脂脑蛋白粉按照体积比为1:200的比例加入去离子水,磁力搅拌20-40min,置于40-60℃水浴中保温0.5-1.5h,使脑蛋白粉完全溶解;逆流脉冲超声波处理:将冷却至室温的脑蛋白粉置于逆流脉冲超声波处理器中处理,其中,超声频率为20kHz,功率为60-100W,超声4-6min,期间超声时间2s,间歇时间2s;步骤三,酶解提取粗猪脑多肽:超声后的猪脑蛋白溶液加入碱性蛋白酶进行酶解,其中酶底比为1000-3000U/g;pH值为8.0-9.0,酶解温度为30-50℃,酶解时间为80-100min;酶解后立即将酶解液置于沸水浴中静置5-15min;待冷却至室温,于8000-12000rpm离心10-20min,取上清液,制得猪脑多肽粗提液;步骤四,分离:将超声辅助酶解得到的猪脑多肽粗提液,采用截留分子量为3-5kDa的超滤膜进行分级分离,收集所得产物冷冻干燥后制得猪脑多肽,其中,控制超滤膜出口压力小于5Bar;步骤五,纯化:利用DEAE-52纤维树脂层析柱对步骤四制备的猪脑多肽进行二次纯化;制得猪脑蛋白抗氧化肽。优选的是,所述预处理中所述脱脂具体包括:将切碎后的新鲜猪脑加入其体积4-6倍的沸水中煮沸5-15min,过滤后再加入2-4倍体积的75-90%的乙醇,60-80℃下脱脂20-40min,冷却至室温,之后于3000-6000rmp离心10-20min,收集沉淀;所述干燥具体指,于烘箱中50-70℃下干燥至恒重。优选的是,所述步骤二的超声波处理过程中用0.1-0.5mol/LNaOH溶液调节所述猪脑蛋白溶液的pH值恒定为8.0-9.0。优选的是,所述步骤五的纯化具体为:称取步骤四制备的猪脑多肽50-100mg,溶于5-10mLpH7.5-8.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液,于3000-5000rpm离心5-10min,取上清液作为进样液;将进样液滴加到DEAE-52纤维树脂层析柱中,依次用pH7.5-8.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液、pH8.0Tris-HCl缓冲液,进行洗脱,使用DHL-A恒流泵,控制流速0.8-1.0mL/min,用自动分部收集器收集,收集液采用截留分子量为300Da的多肽透析袋进行脱盐;脱盐后冷冻干燥制得猪脑蛋白抗氧化肽。优选的是,所述pH8.0Tris-HCl缓冲液含有0.0-2.0mol/L的NaCl。优选的是,所述猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,包括以下步骤:步骤一,预处理:取新鲜猪脑冲洗,切碎,经过脱脂、干燥并研磨成粉,制得脱脂脑蛋白粉备用;所述脱脂具体包括:将切碎后的新鲜猪脑加入其体积4-6倍的沸水中煮沸5-15min,过滤后再加入2-4倍体积的75-90%的乙醇,60-80℃下脱脂20-40min,冷却至室温,之后于3000-6000rmp离心10-20min,收集沉淀;所述干燥具体指,于烘箱中50-70℃下干燥至恒重;步骤二、超声波处理猪脑蛋白粉:取步骤一制得的脱脂脑蛋白粉按照体积比为1:200的比例加入去离子水,磁力搅拌20-40min,置于40-60℃水浴中保温0.5-1.5h,使脑蛋白粉完全溶解;用0.1-0.5mol/LNaOH溶液调节所述猪脑蛋白溶液的pH值恒定为8.0-9.0;逆流脉冲超声波处理:将冷却至室温的脑蛋白粉置于逆流脉冲超声波处理器中处理,其中,超声频率为20kHz,功率为60-100W,超声4-6min,期间超声时间2s,间歇时间2s;步骤三,酶解提取粗猪脑多肽:超声后的猪脑蛋白溶液加入碱性蛋白酶进行酶解,其中酶底比为1000-3000U/g;pH值为8.0-9.0,酶解温度为30-50℃,酶解时间为80-100min;酶解后立即将酶解液置于沸水浴中静置5-15min;待冷却至室温,于8000-12000rpm离心10-20min,取上清液,制得猪脑多肽粗提液;步骤四,分离:将超声辅助酶解得到的猪脑多肽粗提液,采用截留分子量为3-5kDa的超滤膜进行分级分离,收集所得产物冷冻干燥后制得猪脑多肽,其中,控制超滤膜出口压力小于5Bar;步骤五,纯化:利用DEAE-52纤维树脂层析柱对步骤四制备的猪脑多肽进行二次纯化;制得猪脑蛋白抗氧化肽;所述纯化具体为:称取步骤四制备的猪脑多肽50-100mg,溶于5-10mLpH7.5-8.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液,于3000-5000rpm离心5-10min,取上清液作为进样液;将进样液滴加到DEAE-52纤维树脂层析柱中,依次用pH7.5-8.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液、pH8.0Tris-HCl缓冲液,进行洗脱,使用DHL-A恒流泵,控制流速0.8-1.0mL/min,之后将收集到的液体再次滴加到DEAE-52纤维树脂层析柱中进行二次纯化后得收集液,收集液采用截留分子量为300Da的多肽透析袋进行脱盐;脱盐后冷冻干燥制得猪脑蛋白抗氧化肽;所述pH8.0Tris-HCl缓冲液含有0.0-2.0mol/L的NaCl。本专利技术至少包括以下有益效果:本专利技术所述猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,将猪脑蛋白粉溶液在酶解之前采用逆流脉冲超声波处理,猪脑蛋白经超处理声后,更多的脑蛋白中的肽键被暴露,从而有利于蛋白酶发挥蛋白的酶解作用。将较于常规的酶解方式,本专利技术中蛋白酶解度提高了30.6%。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法中水解曲线图;图2为本专利技术所述猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法酶解后多肽的浓度曲线图;图3为本专利技术猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法中不同浓度UPCHPs清除ABTS+·能力曲线图;图4为本专利技术猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法中UPCHPs超滤组本文档来自技高网...
猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法

【技术保护点】
一种猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一,预处理:取新鲜猪脑冲洗,切碎,经过脱脂、干燥并研磨成粉,制得脱脂脑蛋白粉备用;步骤二、超声波处理猪脑蛋白粉:取步骤一制得的脱脂脑蛋白粉按照体积比为1:200的比例加入去离子水,磁力搅拌20‑40min,置于40‑60℃水浴中保温0.5‑1.5h,使脑蛋白粉完全溶解;逆流脉冲超声波处理:将冷却至室温的脑蛋白粉置于逆流脉冲超声波处理器中处理,其中,超声频率为20kHz,功率为60‑100W,超声4‑6min,期间超声时间2s,间歇时间2s;步骤三,酶解提取粗猪脑多肽:超声后的猪脑蛋白溶液加入碱性蛋白酶进行酶解,其中酶底比为1000‑3000U/g;pH值为8.0‑9.0,酶解温度为30‑50℃,酶解时间为80‑100min;酶解后立即将酶解液置于沸水浴中静置5‑15min;待冷却至室温,于8000‑12000rpm离心10‑20min,取上清液,制得猪脑多肽粗提液;步骤四,分离:将超声辅助酶解得到的猪脑多肽粗提液,采用截留分子量为3‑5kDa的超滤膜进行分级分离,收集所得产物冷冻干燥后制得猪脑多肽,其中,控制超滤膜出口压力小于5Bar;步骤五,纯化:利用DEAE‑52纤维树脂层析柱对步骤四制备的猪脑多肽进行二次纯化;制得猪脑蛋白抗氧化肽。...

【技术特征摘要】
1.一种猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一,预处理:取新鲜猪脑冲洗,切碎,经过脱脂、干燥并研磨成粉,制得脱脂脑蛋白粉备用;步骤二、超声波处理猪脑蛋白粉:取步骤一制得的脱脂脑蛋白粉按照体积比为1:200的比例加入去离子水,磁力搅拌20-40min,置于40-60℃水浴中保温0.5-1.5h,使脑蛋白粉完全溶解;逆流脉冲超声波处理:将冷却至室温的脑蛋白粉置于逆流脉冲超声波处理器中处理,其中,超声频率为20kHz,功率为60-100W,超声4-6min,期间超声时间2s,间歇时间2s;步骤三,酶解提取粗猪脑多肽:超声后的猪脑蛋白溶液加入碱性蛋白酶进行酶解,其中酶底比为1000-3000U/g;pH值为8.0-9.0,酶解温度为30-50℃,酶解时间为80-100min;酶解后立即将酶解液置于沸水浴中静置5-15min;待冷却至室温,于8000-12000rpm离心10-20min,取上清液,制得猪脑多肽粗提液;步骤四,分离:将超声辅助酶解得到的猪脑多肽粗提液,采用截留分子量为3-5kDa的超滤膜进行分级分离,收集所得产物冷冻干燥后制得猪脑多肽,其中,控制超滤膜出口压力小于5Bar;步骤五,纯化:利用DEAE-52纤维树脂层析柱对步骤四制备的猪脑多肽进行二次纯化;制得猪脑蛋白抗氧化肽。2.如权利要求1所述的猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于,所述预处理中所述脱脂具体包括:将切碎后的新鲜猪脑加入其体积4-6倍的沸水中煮沸5-15min,过滤后再加入2-4倍体积的75-90%的乙醇,60-80℃下脱脂20-40min,冷却至室温,之后于3000-6000rmp离心10-20min,收集沉淀;所述干燥具体指,于烘箱中50-70℃下干燥至恒重。3.如权利要求1所述的猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于,所述步骤二的超声波处理过程中用0.1-0.5mol/LNaOH溶液调节所述猪脑蛋白溶液的pH值恒定为8.0-9.0。4.如权利要求1所述的猪脑蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于,所述步骤五的纯化具体为:称取步骤四制备的猪脑多肽50-100mg,溶于5-10mLpH7.5-8.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液,于3000-5000rpm离心5-10min,取上清液作为进样液;将进样液滴加到DEAE-52纤维树脂层析柱中,依次用pH7.5-8.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液、pH8.0Tris-HCl缓冲液,进行洗脱,使用DHL-A恒流泵,控制流速0.8-1.0mL/min,用自动分部收集器收集,收集液采用截留分子量为300Da的多肽透析袋进行脱盐;脱盐后冷冻干燥制得猪脑蛋白抗氧化肽。5.如权利要求4所述的猪脑蛋白抗氧...

【专利技术属性】
技术研发人员:邹烨王道营卞欢李鹏鹏蔡盼盼王立孙冲孙芝兰徐为民
申请(专利权)人:江苏省农业科学院
类型:发明
国别省市:江苏;32

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