壳聚糖亲和七肽及其筛选方法和应用技术

技术编号:14887863 阅读:122 留言:0更新日期:2017-03-28 17:56
本发明专利技术公开壳聚糖亲和七肽,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6任一所示。筛选是以离子凝胶化方法制备包裹壳聚糖的纳米颗粒,之后将其与噬菌体展示肽库混合,通过离心分离对肽库进行筛选,最后对筛选得到的噬菌体克隆进行ELISA鉴定及序列分析。本发明专利技术提供的短肽可以较强的亲和力结合在壳聚糖材料表面,并可改变壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒的表面性质,从而扩大其使用范围,这为开发以壳聚糖为基础的纳米材料特别是纳米颗粒药物载体提供了更多的材料、方法和途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米生物材料领域,更具体地讲,涉及壳聚糖亲和七肽及其应用。
技术介绍
壳聚糖(chitosan)是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然有机高分子化合物,是唯一大量存在的碱性多糖,具有良好的生物相容性、可降解性、高电荷密度和抗菌性,从而具有独特的理化性质和生物功能,通常是甲壳素(chitin)脱乙酰化来获得。壳聚糖在生物医药领域应用广泛,而大多数生物分子与壳聚糖作用的方式是依靠非特异性相互作用,如果能够有一种方法能控制壳聚糖的特性,例如辅助壳聚糖制成纳米颗粒,提高壳聚糖与其他生物分子的识别性和特异性,这将大大提高壳聚糖的功能。目前,噬菌体展示技术已被用于筛选各种无机材料和纳米结构的亲和性多肽,通过噬菌体展示肽库筛选得到的多肽可以对材料进行功能化,控制材料的形貌,以此提高材料的性能。但是,由于壳聚糖材料的柔性和多孔等特点,通过噬菌体展示肽库的筛选来获得壳聚糖亲和多肽的方法及亲和多肽都没有报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供壳聚糖亲和七肽。本专利技术的第二个目的在于提供壳聚糖亲和七肽的筛选方法。本专利技术的第三个目的在于提供壳聚糖亲和七肽的应用。为实现本专利技术第一个目的,本专利技术公开以下技术方案:壳聚糖亲和七肽,其特征在于,其氨基酸序列为SEQIDNO.1~SEQIDNO.6任一所示。为实现本专利技术第二个目的,本专利技术公开以下技术方案:壳聚糖亲和七肽的筛选方法,其特征在于,所述筛选方法包括以离子凝胶化方法制备包裹壳聚糖的纳米颗粒,之后将其与噬菌体展示肽库混合,通过离心分离对肽库进行筛选,最后对筛选得到的噬菌体克隆进行ELISA鉴定及序列分析。为实现本专利技术第三个目的,本专利技术公开以下技术方案:壳聚糖亲和七肽在壳聚糖表面进行修饰和功能化中的应用。壳聚糖亲和七肽在制备壳聚糖亲和材料中的应用。SEQIDNO.1:GQSEKHL(GlyGlnSerGluLysHisLeu);SEQIDNO.2:VSRDTPQ(ValSerArgAspThrProGln);SEQIDNO.3:TVNFKLY(ThrValAsnPheLysLeuTyr);SEQIDNO.4:HGGVRLY(HisGlyGlyValArgLeuTyr);SEQIDNO.5:ADRFQAL(AlaAspArgPheGlnAlaLeu);SEQIDNO.6:HYIDFRW(HisTyrIleAspPheArgTrp)。本专利技术的优点在于:本专利技术是以壳聚糖包裹的纳米颗粒来实施对壳聚糖亲和多肽的筛选,以此避免不易在平板表面形成壳聚糖涂敷层的问题,并且避免了采用平板筛选时的材料聚苯乙烯PS的影响。所筛选得到的包含亲和多肽的噬菌体单克隆对壳聚糖涂层具备强于原始肽库的亲和力;筛选得到的亲和肽,均可以改变壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒的表面性质,可以显著提高纳米颗粒在碱性条件下的稳定性,这为纳米颗粒在碱性条件下的使用提供帮助。附图说明图1.介孔硅纳米颗粒和壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒透射电镜图,左侧:介孔硅纳米颗粒,右侧:壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒。图2.壳聚糖亲和多肽氨基酸残基亲疏水性分析。图3.(A)不同噬菌体的吸附等温曲线(B)噬菌体浓度为800pM时,不同噬菌体的相对亲和力大小(■):噬菌体C1(展示多肽P1);(●):噬菌体C2(展示多肽P2);(▲):噬菌体C3(展示多肽P3);噬菌体C4(展示多肽P4);噬菌体C5(展示多肽P5);噬菌体C6(展示多肽P6)(◆):原始肽库噬菌体。图4.不同浓度亲和多肽与壳聚糖相互作用,A)多肽P2,B)多肽P3。图5.多肽吸附包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒后在不同pH条件下的Zeta电位。图6.多肽在壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒上的吸附量测定。具体实施方式下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。应理解,这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例结合噬菌体的淘选包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒的制备羧基化介孔硅纳米颗粒的合成:首先称取全氟丁基磺酰氟FC-40.8g和混合嵌段式聚醚F-1270.65g,依次加入到0.02M的40mlHCl溶液中,然后在250ml的三角烧瓶中冷凝回流,在全氟丁基磺酰氟FC-4溶解完全时,加入四乙氧基硅烷(TEOS)2.2g到混合物中,在30℃下强力搅拌20h,当混合液变成白色乳浊状态时,升温到100℃,继续强力搅拌24h。将所得到的产物在室温下冷却,使用超纯水和纯乙醇的混合液在12,000rpm转速下洗涤产物三次,将所得到的固体在真空干燥箱烘干后,使用管式炉在550℃下煅烧3h,得到介孔硅颗粒。称取100mgMSNs,然后加入到含有0.25ml3-丙氨基三乙氧基硅烷的20ml无水乙醇溶液中,在室温状态下剧烈搅拌24h。然后,使用无水乙醇反复多次洗涤混合物,并在60℃下真空干燥,得到氨基修饰的介孔硅颗粒(MSNs-NH2)。称取20mg的丁二酸酐,加入到10mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,再加入50mgMSNs-NH2,在室温状态下剧烈搅拌12h后,使用乙醇和去离子水洗涤多次,然后在60℃下真空干燥,得到羧基修饰的介孔硅颗粒(MSNs-COOH)。称取0.2g壳聚糖,溶于200ml1%乙酸溶液中,在磁力搅拌器上搅拌24h。然后使用0.5MNaOH将壳聚糖溶液pH调至6.0。将调节pH后的溶液使用0.45μM的滤膜抽滤,除去不溶的壳聚糖颗粒。称取0.1g羧基化的介孔硅纳米颗粒加入到20ml壳聚糖溶液中,在磁力搅拌器上连续搅拌36h。将溶液转移到离心管中12000rpm离心30min,倒掉上清,使用超纯水重悬,重复2次上述重悬离心步骤,最后真空干燥。包裹介孔硅壳聚糖纳米颗粒的Zeta电位称取50mg包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒溶于50ml超纯水中,超声分散30min。使用马尔文纳米激光粒度仪测量包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒的粒径和Zeta电位。包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒TEM用于透射电镜(TEM)观察的样品的前处理和制备方法如下:(1)将制备好的包裹介孔硅壳聚糖纳米颗粒超声分散于超纯水中(2)使用微量移液器枪吸取10μL上述分散液小心滴在有碳膜支持的电镜铜网上。(3)在室温下放置干燥后,将电镜铜网装进电镜样品杆中。在电镜样品室中放入样品杆准备进行观察。结果如图1.噬菌体肽库筛选壳聚糖亲和多肽包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒亲和多肽筛选(1)称取50mg包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒溶于50mlTBST(0.2%Tween-20)中,超声分散30min。(2)取1ml上述溶液加入1.5mlEP管中,然后加入10μl原始七肽库,在室温下旋转震荡60min。(3)12000rpm,10min离心上一步溶液,并使用TBST(0.2%Tween-20)洗沉淀10次,在最后一次洗沉淀后将溶液转移到新的EP管中,并离心倒掉上清。(4)在EP管中加入非特异性缓冲溶液0.2MGly-HCl(pH2.2),1mg/mlBSA分离颗粒上结合的噬菌体:温和摇动10min后,16,000rpm离心10min,将上清吸取到另一个干净EP管中,然后在加入1/6体积1MTris-HCl(pH9.1)中本文档来自技高网...
<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201610979474.html" title="壳聚糖亲和七肽及其筛选方法和应用原文来自X技术">壳聚糖亲和七肽及其筛选方法和应用</a>

【技术保护点】
壳聚糖亲和七肽,其特征在于,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6任一所示。

【技术特征摘要】
1.壳聚糖亲和七肽,其特征在于,其氨基酸序列为SEQIDNO.1~SEQIDNO.6任一所示。2.权利要求1所述壳聚糖亲和七肽的筛选方法,其特征在于,所述筛选方法包括以离子凝胶化方法制备包裹壳聚糖的纳米颗粒,之后将其与噬菌体展...

【专利技术属性】
技术研发人员:王宜冰于勇姚文基王平
申请(专利权)人:华东理工大学
类型:发明
国别省市:上海;31

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1