电荷反转的DNA纳米载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了电荷反转的DNA纳米载体及其制备方法和应用，属于基因治疗和DNA疫苗抗体表达的领域，电荷反转的DNA纳米载体包括甲基丁二酸‑3‑二甲氨基‑1‑丙基酯季铵盐与pDNA形成的复合物，不同pH条件下带电荷量的不同，在相应的PH条件下可以进行电荷反转，本发明专利技术制备的电荷反转复合物具有pH响应性，通过甲基丁二酸‑3‑二甲氨基‑1‑丙基酯季铵盐在不同pH条件下带电荷量的不同，在某一个PH条件下进行电荷反转，通过带负电的细胞膜表面时，纳米复合物带正电，与细胞膜有很高的亲和性，更能有效被内化，进入细胞中不同的pH条件下，发生电荷反转，负电荷的载体在血管中更容易长效循环，更加适合基因治疗和抗体生产的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因治疗和抗体生产领域，尤其涉及电荷反转的DNA纳米载体及其制备方法和应用。
技术介绍
随着社会经济的繁荣与进步，健康问题越来越受到人们的重视。在致命的10大疾病中，排名前几的心脏病、恶性肿瘤、脑血管病变、糖尿病严重影响人们的生活，而且这些疾病还呈增长趋势，死亡率也越来越高，趋向于年轻化，这些疾病常常会引起很多并发症。基因治疗给人们带来了曙光，从1990年至今，实现了在生物医药领域和临床上基因治疗对人类疾病进行基因干预治疗，在治疗疾病的潜力得到了认可，比传统治疗疾病的方法有很多不可比拟的优点。基因治疗已经成为当代生命科学领域最具前景性的研究方向。2003年基因组计划的成功，推动了基因治疗的进步。基因治疗旨在改变基因水平，有DNA和mRNA两个水平。2009年美国就有354项关于基因治疗的计划在试行，远远超出了2008年的全球的116项。英国在2014年推出了“十万基因组计划”拟通过对基因组进行测序，有效确定引发癌症及其他疾病的基因。抗体也是生物科学领域的主力军，最普遍的用法是通过Westernblot去揭示细胞中特定蛋白的表达量的多少，抗体另一方面还被用于荧光染色和免疫组化。根据2015年Biocompare发表的一份报告，在科研上用于抗体的生产的市场规模很庞大，并且仍在增长，抗体的种类也越来越多，但是抗体的质量得不到保证，在抗体的购买方面损失了很多的资金，只科研用于抗体市场规模就达到25亿美金，每年因购买质量差的抗体导致的损失达到8亿美金。2015年9月Uhlén和美国实验生物学学会联合会分别举办了关于抗体迫在眉睫的问题的解决的会议，解决方案之一就是抗体的效果的评价。同一种抗体在几次试验下表现出的性质不同，会产生不可预料的结果。斯坦福大学反向DNA疫苗开创一型糖尿病新疗法，这种疫苗是以基因工程技术为基础的反向DNA疫苗，通过靶向抑制异常表达的T细胞保护胰岛B细胞不受伤害，来治疗糖尿病。2015年4月，科学家证明了纳米涂层细菌能有效转运口服DNA疫苗，这种疫苗可以刺激人体的免疫系统发挥作用治疗疾病，主要目的是有效增加口服疫苗生物利用度，寻找一个有效的载体物质。一些常见的方法如基因枪法、电穿孔法、显微注射等方法，但这些方法目前的缺点是无法确保基因进入体内不被降解、无靶向性、会产生机体的免疫反应，目前阳离子聚合物载体作为非病毒型载体已经受到了人们的重视，将潜在的病毒型载体的安全性隐患排除。这种阳离子载体既可应用于基因治疗又可简化疫苗的生产以及DNA疫苗的不成熟性，可保护DNA进入体内不被DNA水解酶水解。常见的阳离子聚合物基因载体毒性低、转染效率高、具有靶向性且在细胞内无明显免疫反应。因此合成以阳离子聚合物为基础的DNA纳米载体载体很有意义和应用前景。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种电荷反转的DNA纳米载体及其制备方法和应用。本专利技术的具体技术方案如下：一种电荷反转的DNA纳米载体，包括甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐与pDNA形成的复合物，不同pH条件下带电荷量的不同，在相应的PH条件下可以进行电荷反转。本专利技术还通过一种制备上述电荷反转的DNA纳米载体的方法，步骤如下：（一）制备丁二酸甲酯称取丁二酸,Dowex50W-X2，加入到甲酸甲酯/辛烷的混合液中，80℃水浴反应持续12h，将溶液过滤并蒸干，然后通过色谱纯对所得产物进行纯化，即为丁二酸甲酯；所述丁二酸与甲酸甲酯的摩尔比为1:2;（二）制备甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯称取上步所得丁二酸甲酯、0.5倍丁二酸甲酯摩尔量的3-二甲基氨基-1-丙醇和1/5丁二酸甲酯摩尔量的4-甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷中，得到溶液1：将4倍丁二酸甲酯摩尔量的二环己基碳二亚胺溶解在二氯甲烷中，得到溶液2，备用：另外将溶液2加入到溶液1中，持续搅拌2d，然后过滤除去不溶物后将溶剂挥发，得到甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯；（三）制备甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐将上步所得甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯溶解在二氯甲烷中，加入3倍丁二酸甲酯摩尔量的MeI，在室温下搅拌4h后蒸发浓缩，残余物通过二氯甲烷/乙醚混合溶液进行重结晶，得到甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐；（四）以0.2PH为间隔配制3.2-8.0pH梯度的pH缓冲溶液，将上步所得甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐加入不同pH的缓冲溶液中，测定甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐所带电荷量，并找到电荷反转的点；（五）制备电荷反转DNA复合物1.称取步骤三中所的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐溶解在灭菌水中，调节其pH值使其符合使用环境，通过0.22µm滤膜进行灭菌操作，放入无菌操作台备用；2.将上步所得季铵盐溶液加入离心管1中，将pDNA加入离心管2中，加入无菌水稀释至2µg/mL，备用；按照药用比例设定将稀释后的pDNA分批加入离心管1中，涡旋30s后将离心管1放入孵育器中，在37℃条件下孵育1h，即得。作为优选项：所述步骤（一）中，甲酸甲酯/辛烷混合液中甲酸甲酯与辛烷体积比为2:8。作为优选项：所述步骤（五）1中，调节甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐溶液pH值的调节剂为0.1MHCl或0.1MNaOH。作为优选项：所述步骤（五）2中，将稀释后的pDNA分批加入离心管1中的具体操作为将稀释后的pDNA按照每次15µL的量加入到离心管1中。本专利技术制备的电荷反转复合物具有pH响应性，通过甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐在不同pH条件下带电荷量的不同，在某一个PH条件下进行电荷反转，通过带负电的细胞膜表面时，纳米复合物带正电，与细胞膜有很高的亲和性，更能有效被内化，进入细胞中不同的pH条件下，发生电荷反转，更加有利于载体进入细胞，负电荷的载体在血管中更容易长效循环，更加适合基因治疗和抗体生产的应用。本专利技术的DNA纳米载体，可以与不同浓度的可以表达绿色荧光蛋白的pDNA进行结合，从而可以对各个环节进行综合评价，更好的用于生物检测。本专利技术制备的电荷反转复合物也是利用静电作用与DNA结合，实现在不同pH条件下复合物的电荷不同，在某一个pH值可以实现电荷正负的变化，从而更加适应生物体内的微环境，能很好的应用在基因治疗和抗体生产。综上所述，本专利技术的优点和有益效果为：1、本专利技术制备方法工艺简单，成本低；2、本专利技术制备的纳米颗粒稳定性好，并且在水中分散性好，粒径可控；3、本专利技术制备的pDNA纳米载体比在PBS和油相中尺寸和带电荷量影响更小；4、本专利技术制备的纳米颗粒比两单体的物质稳定性更好，更能改变整个物质的电荷分布，更加适合基因治疗和抗体生产的应用。5、电荷反转复合物在不同pH条件下带电荷量的不同，在某一个PH条件下进行电荷反转，通过带负电的细胞膜表面时，纳米复合物带正电，与细胞膜有很高的亲和性，更能有效被内化，进入细胞中不同的pH条件下，发生电荷反转，负电荷的载体在血管中更容易长效循环，更加适合基因治疗和抗体生产的应用。附图说明图1为本专利技术中电荷反转复合物的制备过程示意图；图2为本专利技术制备的载体进入细胞示意图。具体实施方式制备电荷反转/DNA复合物(1)制备丁二酸甲酯称取一定量的丁二酸，Dowe本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电荷反转的DNA纳米载体，其特征在于：包括甲基丁二酸‑3‑二甲氨基‑1‑丙基酯季铵盐与pDNA形成的复合物，不同pH条件下带电荷量的不同，在相应的PH条件下可以进行电荷反转。

【技术特征摘要】
1.一种电荷反转的DNA纳米载体，其特征在于：包括甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐与pDNA形成的复合物，不同pH条件下带电荷量的不同，在相应的PH条件下可以进行电荷反转。2.一种制备如权利要求1所述的电荷反转的DNA纳米载体的方法，其特征在于：步骤如下：（一）制备丁二酸甲酯称取丁二酸,Dowex50W-X2，加入到甲酸甲酯/辛烷的混合液中，80℃水浴反应持续12h，将溶液过滤并蒸干，然后通过色谱纯对所得产物进行纯化，即为丁二酸甲酯；所述丁二酸与甲酸甲酯的摩尔比为1:2;（二）制备甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯称取上步所得丁二酸甲酯、0.5倍丁二酸甲酯摩尔量的3-二甲基氨基-1-丙醇和1/5丁二酸甲酯摩尔量的4-甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷中，得到溶液1：将4倍丁二酸甲酯摩尔量的二环己基碳二亚胺溶解在二氯甲烷中，得到溶液2，备用：另外将溶液2加入到溶液1中，持续搅拌2d，然后过滤除去不溶物后将溶剂挥发，得到甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯；（三）制备甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐将上步所得甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯溶解在二氯甲烷中，加入3倍丁二酸甲酯摩尔量的MeI，在室温下搅拌4h后蒸发浓缩，残余物通过二氯甲烷/乙醚混合溶液进行重结晶，得到甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季铵盐；（四）以0...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宏浩，王甜甜，廖天作，祝红达，刘明星，郭惠玲，孙红梅，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42