一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)配制壳聚糖溶液；(2)制备壳聚糖纳米纤维；(3)化学固载：取核酸适配体溶液，加入EDC/NHS溶液活化后，再加入步骤(2)所得的壳聚糖纳米纤维，常温下震荡反应；(4)后处理：对步骤(3)所得的反应混合液进行固液分离，得到所述的核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维。本发明专利技术所述的核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维适用于食品、环境中痕量或超痕量真菌毒素类物质或其他物质的高选择性分离与富集，具有选择性高、萃取容量大、稳定性高和制备简单的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学分析测试
，涉及到分散固相微萃取技术，具体涉及一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维吸附剂的制备方法，该纳米纤维适用于复杂样品中痕量或超痕量真菌毒素等组分的高选择性分离富集。
技术介绍
由于受待测组分状态、共存组分干扰或测定方法灵敏度低等问题的限制，绝大多数化学检测和分析方法都要求事先对样品进行有效、合理的预处理，以达到富集、提纯的效果。但相对于仪器分析技术的快速发展，样品前处理技术的进展较为缓慢。目前常用的样品前处理技术如液液萃取、柱层析等普遍存在耗时、低效、有机溶剂用量大、操作较繁琐、选择性差等问题，导致样品前处理成为整个分析过程中最费时费力的环节，同时也在样品分析过程中引入了至少三分之一的误差。为此，简单、快速、高效、绿色、高选择性的样品前处理技术是实现复杂样品如血浆、尿液、医药、环境、食品样品中痕量或超痕量待测组分分离富集急需发展的关键技术。固相萃取技术由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来，目前已成为应用最为广泛的新型样品前处理方法之一。近年来固相萃取技术取得了长足的进步，已衍生出众多新型固相萃取方法如固相动态萃取、基质分散固相萃取、搅拌棒吸附萃取、固相微萃取、自动顶空动态固相萃取等，而吸附剂作为这些技术的核心，其种类也越来越趋于多样化，一些新型的材料如磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、碳纳米材料、纳米纤维等均被用作固相萃取吸附剂或吸附剂底材。纳米纤维因为具有连续、整体的结构，与纳米粒子吸附剂相比具有背景压力低、形式多样、萃取简单、容易分离等诸多优点，且在实验过程中仅需借助涡旋或震荡就能取得很好的吸附萃取分离效果，在样品前处理技术领域引起广泛关注。纳米纤维可利用多种高分子材料制备得到，如聚乙烯醇、聚丙烯腈、聚乙二醇以及壳聚糖等。壳聚糖因其具有生物相容好、原材料易得等优点，在很长一段时间内一直是新型材料领域内炙手可热的研究对象。采用壳聚糖制备纳米纤维的技术有很多种，如静电纺丝技术、超声研磨法、冷冻干燥法等。其中，静电纺丝技术是制备纳米纤维的基本方法，但在试验过程中需用到有机溶剂，从而影响壳聚糖纳米纤维的生物相容性。而超声碾磨法的最大优点是操作简单，但制得的壳聚糖纳米纤维存在均一性及重复性较差的问题。冷冻干燥法是壳聚糖纳米纤维制备的新兴技术，具有操作简单、方便及环保等特点，该方法制备纳米纤维的原理是通过升华的方法将壳聚糖溶液中水分子除去，在此过程中由于壳聚糖分子之间具有很强的静电吸附作用而首尾连接，微观上形成一根根纳米纤维，制得的纳米纤维均一性、生物相容性好，表面具有丰富的羟基和氨基基团，易于化学改性，具有广泛的应用潜力。选择性差是目前商品化固相萃取存在的主要问题，为了实现特异性吸附，相关研究者选择在吸附剂材料修饰选择性识别功能团如冠醚、杯芳烃、分子印迹聚合物、抗体等。其中，分子印迹聚合物因具有选择性高、稳定性好、制备简单等特点成为固相吸附材料的研究热点。但分子印迹聚合物在合成过程中不可避免地产生非特异性结合位点，与此同时其刚性识别位点在萃取过程中易被破坏，因此在分析应用中受到一定限制。基于抗体-抗原相互作用的生物识别体系在固相萃取技术中也获得了一定的应用。但自1990年Tuerk和Ellington分别从约含1015种寡核苷酸分子的文库中筛选出RNA型核酸适配体以来，抗体技术受到巨大挑战。核酸适配体是经体外筛选技术-指数富集的配基系统进化技术从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合目标配体的单链寡核苷酸序列(DNA或RNA)，一般是由几十个核苷酸组成，具有高度专一性、高亲和力、可重复合成、稳定性好、容易修饰的特点。当目标配体出现时适配体通过改变自身二级结构形成稳定的三级结构与目标配体形成新复合物，新复合物的解离常数通常在nmol和μmol范围内，有的甚至达到pmol，因此核酸适配体对于目标配体分子具有极高的特异性识别能力，且通过化学改性技术可修饰于固体吸附剂表面，在固相萃取技术中具备极大的应用潜力。目前，核酸适配体的载体有水凝胶、脂质体、胶团、金属、硅胶、玻璃、量子点等材料，固载方法有多聚物包埋、物理吸附、直接自组装、间接自组装等，但普遍存在固载率较低、固载不牢固、适配体易流失、材料易破损等问题。
技术实现思路
针对现有固相萃取技术选择性差、核酸适配体固载率低等问题，本专利技术将核酸适配体亲合力高、特异性强、生物样品相容性好等特性与壳聚糖纳米纤维比表面积大、易于化学改性的优点相结合，研制出一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维，用于复杂样品中痕量或超痕量物质组分的分离和富集，结合高效液相色谱，可实现高选择性、高灵敏度分析检测。本专利技术通过以下技术方案实现：一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：(1)配制壳聚糖溶液：称取壳聚糖粉末，加入乙酸溶解，再加入蒸馏水配成壳聚糖溶液；(2)制备壳聚糖纳米纤维：将步骤(1)所得的壳聚糖溶液置于液氮中冷冻，然后将冷冻至固态的壳聚糖溶液置于低温低压的环境中冷冻干燥，得到壳聚糖纳米纤维；(3)化学固载：取核酸适配体溶液，加入EDC/NHS溶液活化后，再加入步骤(2)所得的壳聚糖纳米纤维，常温下震荡反应；(4)后处理：对步骤(3)所得的反应混合液进行固液分离，得到所述的核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维。本专利技术采用核酸适配体修饰固相萃取吸附剂，核酸适配体能与相应的目标配体高效、专一地结合，因此可提高吸附剂的萃取选择性，与同样具备高结合特异性的抗体相比，核酸适配体还具有目标配体范围广、亲和力高、筛选制备方便、稳定性高、易引入修饰基团以及分子质量小的优点，因此可赋予吸附剂更广的应用范围，提高吸附剂的稳定性、实用性和固载率。其次，本专利技术采用冷冻干燥法制备的壳聚糖纳米纤维作为固相萃取吸附剂，该壳聚糖纳米纤维的均一性、生物相容性好，比表面积大，易于化学改性，相对于传统吸附剂具有背景压力低、接触面积大、传质速率快等优点。再者，本专利技术将分子质量小、所占空间小的核酸适配体与比表面积大的壳聚糖纳米纤维结合，在壳聚糖纳米纤维表面可获得很高的覆盖密度，能更大程度地提高核酸适配体的固载率，从而进一步增大了吸附剂的萃取容量。此外，本专利技术通过化学固载的方式将核酸适配体固定在壳聚糖纳米纤维表面，固载效果稳定，解决了物理吸附和自组装等方式所导致的固载不牢固、核酸适配体易流失、材料易破损等问题。进一步地，所述核酸适配体溶液由末端带羧基标记的核酸适配体与PBS缓冲液配制而成，其核酸适配体的浓度为4.5μg/mL～7.0μg/mL；所述PBS缓冲液的pH值为4.5～6.5。本领域的技术人员可根据需要检测的目标配体，在相应的核酸适配体末端引入羧基，末端带羧基标记的核酸适配体和表面含氨基基团的壳聚糖纳米纤维发生酰胺反应，使核酸适配体共价键合于壳聚糖纳米纤维的表面。相对于借助链霉亲和素与生物素的特异性相互作用，即将带有生物素标记的核酸适配体固定在链霉亲和素修饰的吸附剂上的非共价键合方法，本专利技术只需在核酸适配体中引入羧基，不需对本身表面含氨基的壳聚糖纳米纤维进行修饰，操作步骤简便易实现，制备成本低，并且避免修饰后核酸适配体的分子量和所占空间过大，防止空间阻碍导致固载率降低。进一步地，所述核酸适配体溶液为玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液。进一步地，在步骤(3)中，常温下震荡反应不超过1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：(1)配制壳聚糖溶液：称取壳聚糖粉末，加入乙酸溶解，再加入蒸馏水配成壳聚糖溶液；(2)制备壳聚糖纳米纤维：将步骤(1)所得的壳聚糖溶液置于液氮中冷冻，然后将冷冻至固态的壳聚糖溶液置于低温低压的环境中冷冻干燥，得到壳聚糖纳米纤维；(3)化学固载：取核酸适配体溶液，加入EDC/NHS溶液活化后，再加入步骤(2)所得的壳聚糖纳米纤维，常温下震荡反应；(4)后处理：对步骤(3)所得的反应混合液进行固液分离，得到所述的核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维。

【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：(1)配制壳聚糖溶液：称取壳聚糖粉末，加入乙酸溶解，再加入蒸馏水配成壳聚糖溶液；(2)制备壳聚糖纳米纤维：将步骤(1)所得的壳聚糖溶液置于液氮中冷冻，然后将冷冻至固态的壳聚糖溶液置于低温低压的环境中冷冻干燥，得到壳聚糖纳米纤维；(3)化学固载：取核酸适配体溶液，加入EDC/NHS溶液活化后，再加入步骤(2)所得的壳聚糖纳米纤维，常温下震荡反应；(4)后处理：对步骤(3)所得的反应混合液进行固液分离，得到所述的核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维。2.如权利要求1所述核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体溶液由末端带羧基标记的核酸适配体与PBS缓冲液配制而成，其核酸适配体的浓度为4.5μg/mL～7.0μg/mL；所述PBS缓冲液的pH值为4.5～6.5。3.如权利要求2所述的核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体溶液为玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液。4.如权利要求3所述核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，常温下震荡反应不超过12h。5.如权利要求4所述核酸适配体修饰壳聚糖纳米纤维的制备方法，其特征在于：步骤(3)为：取浓度为4.5μg/mL～7.0μg/mL的核酸适配体溶液，加入摩尔比为1∶1～6的EDC/NHS溶液活化后，再加入步骤(2)所得的壳聚糖纳米纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小刚，刘炉英，刘锦辉，巫宝霞，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44