一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法技术

本申请公开了一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，利用进样口和出样口之间的液面高度差产生的压力驱动细胞植入主通道，借助微流体的层流特性使不同种细胞分别固定在主通道各自特定区域，异种细胞间没有物理接触，但处于相同培养环境，在显微镜下可以直接观察细胞形态变化、迁移等生物学行为，为研究细胞间相互作用提供了新思路和新技术。该微流控芯片细胞共培养模型实现了异种细胞非接触式共培养，具有简单易行、直观、微型化、制作成本低以及试剂与样品用量少等特点。

【技术实现步骤摘要】

本申请属于细胞培养
，特别是涉及一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法。
技术介绍
细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞与细胞之间相互交流从而构成了完整的个体，研究细胞间相互作用，是当今医学和生物界的研究热点，是探索生命奥秘和治疗疾病的关键。细胞共培养是研究细胞间相互作用的重要方法，传统的细胞共培养方法可以分为直接接触式(混合)共培养和非直接接触式共培养。直接接触式共培养将两种及两种以上细胞按照一定比例混合培养，但是两种细胞分离较困难，不便于观察和后续检测。非直接接触式共培养是指将两种及两种以上细胞分别接种于不同的载体上，然后将这些载体置于同一个培养环境之中，如Transwell小室共培养方法，然而这种方法无法动态观察细胞行为变化，细胞用量多，无法实施流体控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，以克服现有技术中的不足。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本申请实施例公开一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，包括步骤：(1)、提供一微流控芯片，该芯片包括基材以及形成于所述基材内的沟道，所述沟道包括培养主通道、以及连通于所述培养主通道一端的至少3个分支通道，每个所述分支通道分别形成有一与外部连通的进样口，所述培养主通道的另一端形成有与外部连通的出样口和细胞代谢物收集口，所述进样口和出样口之间形成有高度差，所述至少3个分支通道由1个培养基通道和至少2个细胞通道组成，其中所述细胞通道与所述培养基通道相邻并分设于所述培养基通道的四周；(2)、从培养基通道的进样口加入空白培养基，同时在细胞通道的进样口分别加入不同种细胞悬液，控制微流体的层流速度，不同种细胞缓慢且平行植入微流控芯片中培养主通道中不同区域，中间形成空白区域；(3)、细胞培养；(4)、细胞活性验证。优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法中，所述步骤(3)中，将微流控芯片置于37℃的5％CO2环境中进行细胞培养。优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法中，所述步骤(4)中，形成细胞单层后，用Hoechst33342和碘化丙啶(PI)双染法检测细胞活性。优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法中，所述培养方法的应用包括：通过显微镜实时观察细胞迁移行为，评价细胞间互相作用；细胞形成细胞单层后，通过显微镜观察细胞形态变化，评价细胞间互相作用；细胞形成细胞单层后，共培养一段时间，原位检测细胞蛋白表达的变化；细胞形成细胞单层后，共培养一段时间，收集芯片内细胞培养液，分析培养液内细胞因子等分泌水平，评价细胞间相互作用。优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法中，所述不同种细胞悬液包括肺癌细胞A549和人肺成纤维细胞HLF。优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法中，所述基材包括上下封接的上层和下层，所述上层的材质为PDMS，所述下层的材质为玻璃或培养皿。优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法中，所述主通道和分支通道位于同一平面，各分支通道的宽度和长度相同。本专利技术可在一块几平方厘米的芯片上进行异种细胞非接触式共培养。相对于传统的研究方法，本专利技术具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点，避免了划痕或胰酶消化形成创口过程中对细胞造成的伤害，并且在显微镜下可以直观区分不同种细胞并观察细胞在生长过程中的形态、迁移、转分化等生物学行为，进而分析细胞间互相作用，在细胞生物学和药物筛选等相关领域中具有良好的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1所示为本专利技术具体实施例中微流控芯片的结构示意图；图2所示为本专利技术具体实施例中不同种细胞植入后的显微镜实时拍摄照片；图3所示为本专利技术具体实施例中显微镜下细胞的生长状态，观察细胞形态、增殖、迁移等生物学行为的记录照片。具体实施方式微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有小型化、集成化、高通量、低能耗、分析快速等特性，已在众多领域获得了广泛应用。借助微流控芯片的微结构模拟细胞生存环境、实现多细胞快速、高效共培养，将成为细胞生物学研究的重要平台。本专利技术以微流控芯片为平台，建立了异种细胞非接触式共培养平台，与显微镜等电子设备相结合，无需染色等操作即可区分不同种细胞并实时监控细胞在相互作用条件下的生物学行为变化。其微米级的通道，能经济合理地利用细胞和试剂等资源，非常适合进行细胞功能研究。为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本专利技术的实施方式仅仅是示例性的，并且本专利技术并不限于这些实施方式。结合图1所示，微流控芯片，包括基材以及形成于基材内的沟道，基材包括上下封接的上层1和下层2，上层的材质优选为PDMS，下层的材质优选为玻璃或培养皿，上层材料经等离子体处理后与玻璃材料或培养皿等材料不可逆封接，保持PDMS表面亲水性。沟道包括培养主通道3、以及连通于培养主通道一端的至少3个分支通道8，每个分支通道分别形成有一与外部连通的进样口4、5和6，培养主通道的另一端形成有与外部连通的出样口和细胞代谢物收集口7，进样口和出样口之间形成有高度差，至少3个分支通道由1个培养基通道和至少2个细胞通道组成，其中细胞通道与培养基通道相邻并分设于培养基通道的四周。进一步地，主通道和分支通道位于同一平面，各分支通道的宽度和长度相同。微流控芯片的制作方法包括步骤：(1)用计算机辅助设计软件(CAD)设计微流控芯片的微通道与微结构；(2)通过软光刻法、模塑法在PDMS材料表面制备微通道、进样口以及出样口结构；(3)将PDMS高压灭菌后，上下两层材料分别进行紫外照射灭菌处理，最后用等离子体活化PDMS芯片表面30-45s，并与玻璃或培养皿等材料不可逆封接。利用微流控芯片进行不同细胞共培养的方法包括(以3个分支通道为例)：(1)用PBS润洗微通道，排除微通道中气泡。(2)向芯片中加入与培养细胞相同的培养基预处理1-2h。(3)分别从进样口4、进样口6加入等量的不同种细胞悬液(肺癌细胞A549、人肺成纤维细胞HLF)，同时从中间进样口5加入空白培养基，控制左、中、右三个样品与出样口的液面高度差，驱动样品平行进入主通道，控制层流速度，使两种细胞悬液缓慢且平行流入细胞培养主通道，从而完成不同种细胞的同时植入，两种细胞植入时不混合，中间形成空白区域，如图2所示。(4)将芯片放入37℃的5％CO2培养环境中培养细胞，在显微镜下实时观察记录细胞的生长状态，观察细胞形态、增殖、迁移等生物学行为，结合图3所示。(5)将芯片放入37℃的5％CO2培养环境中培养细胞，采用Hoechst33342和PI双染法检测两种细胞(A549、HLF)的活性，结果显示两种细胞在该芯片上的成活率均大于90％。在其他实施例中，细胞活性检测方法如DAPI/PI,Calcein-AM/PI等活细胞、死细胞原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，其特征在于，包括步骤：(1)、提供一微流控芯片，该芯片包括基材以及形成于所述基材内的沟道，所述沟道包括培养主通道、以及连通于所述培养主通道一端的至少3个分支通道，每个所述分支通道分别形成有一与外部连通的进样口，所述培养主通道的另一端形成有与外部连通的出样口和细胞代谢物收集口，所述进样口和出样口之间形成有高度差，所述至少3个分支通道由1个培养基通道和至少2个细胞通道组成，其中所述细胞通道与所述培养基通道相邻并分设于所述培养基通道的四周；(2)、从培养基通道的进样口加入空白培养基，同时在细胞通道的进样口分别加入不同种细胞悬液，控制微流体的层流速度，不同种细胞缓慢且平行植入微流控芯片中培养主通道中不同区域，中间形成空白区域；(3)、细胞培养；(4)、细胞活性验证。

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，其特征在于，包括步骤：(1)、提供一微流控芯片，该芯片包括基材以及形成于所述基材内的沟道，所述沟道包括培养主通道、以及连通于所述培养主通道一端的至少3个分支通道，每个所述分支通道分别形成有一与外部连通的进样口，所述培养主通道的另一端形成有与外部连通的出样口和细胞代谢物收集口，所述进样口和出样口之间形成有高度差，所述至少3个分支通道由1个培养基通道和至少2个细胞通道组成，其中所述细胞通道与所述培养基通道相邻并分设于所述培养基通道的四周；(2)、从培养基通道的进样口加入空白培养基，同时在细胞通道的进样口分别加入不同种细胞悬液，控制微流体的层流速度，不同种细胞缓慢且平行植入微流控芯片中培养主通道中不同区域，中间形成空白区域；(3)、细胞培养；(4)、细胞活性验证。2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将微流控芯片置于37℃的5％CO2环境中进行细胞培养。3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的细胞非接触培养方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘雯婷，聂富强，
申请(专利权)人：苏州汶颢芯片科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32