一种检测癌细胞内铜离子的癌细胞靶向荧光探针制造技术

本发明专利技术公开了一种检测癌细胞内铜离子的癌细胞靶向荧光探针，该荧光探针为含有生物素基团的罗丹明衍生物，本发明专利技术的荧光探针易于制备成本低廉，且具有高特异性，可快速检测溶液环境的铜离子，检测过程不会受其他组分的干扰，可用于活癌细胞中铜离子的测定，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于癌细胞内铜离子检测的新型荧光探针及其应用，属于分析化学

技术介绍
铜元素在生物体系内的含量仅次于锌和铁，是生物体系必需的一种微量重金属元素和营养素，对多种有机体的基本生理过程起着至关重要的作用。作为生命体系的重要金属元素，铜离子常以细胞色素氧化酶、过氧化氢歧化酶、络氨酸酶、多巴胺β-强化酶等金属酶的催化辅助因子形式，广泛参与生命体系中的电子传递、氧化还原等一系列生理过程，在生物体内的酶反应、酶转录等过程发挥着重要的作用。生物体系内的铜离子浓度异常时，将导致面克斯综合征、威尔森式综合征、家族性肌萎缩症和阿尔兹海默症等疾病的发生。因此，寻求一种快速灵敏的铜离子检测方法在生命体系研究和医学诊断中具有重要的作用。近期研究报道，相对正常细胞，铜离子能够在肿瘤细胞中产生明显富集，具有更高的浓度。临床研究发现，癌症患者血浆中的铜离子浓度与肿瘤恶化程度以及药物治疗反应密切相关。通过铜离子螯合剂四硫钼酸盐（TM）降低体内铜离子含量，可以显著减缓肿瘤组织中的血管生成，进而抑制肿瘤生长。因此，对癌细胞内的铜离子进行实时快速检测对肿瘤的预防和诊断具有重要意义。传统的检测方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体-质谱法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、分光光度测定方法和循环伏安法等检测铜离子的方法，但这些检测方法需要昂贵复杂的检测设备，且检测过程中较为繁琐，不适合大批量检测和实时检测。相比荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种生物小分子的检测。目前，用于检测细胞内铜离子的荧光探针也得到了迅速发展。但是，目前报道的铜离子荧光探针大都不具备癌细胞靶向，不能区分癌细胞和正常细胞，一般对所有细胞都有相应。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，且具有癌细胞靶向的铜离子荧光探针具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种新型检测癌细胞内铜离子的新型荧光探针及其应用。本专利技术所述的新型检测癌细胞内铜离子的荧光探针为含有生物素基团的罗丹明衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示，其中生物素部分具有癌细胞靶向性，酰肼基团为铜离子响应位点：式（）本专利技术所述检测生物体系内铜离子的荧光探针的制备方法为：将式（Ⅱ）所示的化合物a(1mmol)、水合肼（2mmol）和乙醇(5mL)加入到50mL单口烧瓶中，80℃下加热5小时。冷却至室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到白色产物即为本专利技术所述检测癌细胞内铜离子的荧光探针。式（Ⅱ）本专利技术所述的荧光探针在检测癌细胞内铜离子的应用。本专利技术所述的荧光探针可应用于癌细胞内铜离子的检测评价。其中生物素部分使得该探针具有癌细胞靶向性。该探针作为癌细胞铜离子的特异性探针，在铜离子存在的环境下，可以将酰肼催化水解为羧基，生成具有高荧光发射能力的荧光物质，通过检测不同的荧光强度来测定癌细胞内的铜离子。具体测定方法为：室温条件下，配制5μM荧光探针缓冲溶液（含5%乙腈），加入到具有不同浓度的铜离子溶液系中，测定溶液荧光强度作为铜离子浓度的评价指标。本专利技术所述的荧光探针在硫化氢存在的条件下，罗丹明荧光团的酰肼部分将被催化水解为羧基，此时荧光探针可以发射罗丹明荧光团的红色荧光（峰值约为580nm）。同时，由于生物素具有癌细胞靶向性，可以将癌细胞和正常细胞区分，因此该荧光探针可以用于检测癌细胞内的铜离子。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为530nm，在550~700nm之间进行荧光发射光谱的检测。荧光探针在生物成像应用研究主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。在此基础上，应用本专利技术所述的荧光探针对活癌细胞内的铜离子进行快速检测。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的检测癌细胞内铜离子的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本专利技术所述的检测癌细胞内铜离子的荧光探针具有高特异性，在进行相应铜离子检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活癌细胞内铜离子的实时测定，具有广阔的应用前景。本专利技术所述的检测细胞内铜离子的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（550~700nm），可以实现对细胞中的铜离子快速准确检测的目的。附图说明图1是荧光探针的1HNMR图谱。图2是荧光探针在不同浓度铜离子条件下的荧光光谱。图3是荧光探针与铜离子浓度的线性关系数据。图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱。图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。A图：只加10μM探针的细胞明场照片；B图：只加10μM探针的细胞红色通道荧光照片；C图：A图和B图的叠加照片；D图：加入10μM探针和50μM铜离子的细胞明场照片；E图：加入10μM探针和50μM铜离子的细胞红色通道荧光照片；F图：D图和E图的叠加照片。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术保护内容不仅限于此。实施例1所述检测癌细胞内铜离子的荧光探针的制备将式（Ⅱ）所示的化合物a（1mmol）、水合肼（2mmol）和乙醇（5mL）加入到50mL单口烧瓶中，80℃下加热5小时。冷却至室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇=10:1)纯化，得到黄色产物，即为本专利技术所述检测癌细胞内铜离子的荧光探针，产率73%。上述检测癌细胞内铜离子的荧光探针的1HNMR图谱见图1。实施例2所述荧光探针在不同铜离子浓度下的荧光光谱本专利技术采用硫酸在水溶液中供应铜离子。预先准备10份5mL的5μM探针缓冲溶液，含5%乙腈，所加入的铜离子浓度为0到125μM。然后进行荧光检测（λEx=530nm）；计算各体系中荧光强度；通过分析581nm处的荧光强度与铜离子浓度的关系，评估该探针对铜离子的响应性能（见图2和图3）。图2表明，随着铜离子浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强。图3表明，当铜离子浓度在0~40μM范围内，溶液的荧光强度和铜离子的浓度呈较好的线性关系，可采用公式Y=19.95*X+23.27表示，其中Y为581nm处的荧光强度，X为铜离子的浓度。实施例3荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱预先准备10份5mL的5μM探针缓冲溶液(含5%乙腈，pH=7.4)，然后分别向该体系中依次加入50μL浓度为200μM的Hcys、Na2S、Na2SO3、Cys、GSH、VC、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Co2+等相关分析物的缓冲溶液。然后进行荧光检测（λEx=530nm）；计算各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图4）。从图中看出，当然探针溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、Cys、GSH、VC、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Co2+等相关分析物时，只有铜离子可以导致溶液产生显著的荧光，而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对铜离子有响应，而不受其他小分子的干扰。实施例4荧光探针在活细胞中的成像应用将小鼠乳腺癌细胞（4T1细胞）放在培养基(DMEM培养液和10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测癌细胞内铜离子的癌细胞靶向荧光探针，其特征在于：其含有生物素基团的罗丹明衍生物，所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示：式（）。

【技术特征摘要】
1.一种检测癌细胞内铜离子的癌细胞靶向荧光探针，其特征在于：其含有生物素基团的罗丹明衍生物，所述荧光探针的化学结构通式如式（）所示：式（）。2.一种根据权利要求1所述的检测癌细胞内铜离子的癌细胞靶向荧光探针的制备方法，其特征在于：将1mmol式（Ⅱ）所示的化合物、2m...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，董宝利，王超，孔秀琪，宋学真，张楠，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37