一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白（PA）的方法技术

本发明专利技术提供一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的方法，所述的方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳颗粒。本方法所形成的试剂灵敏度高，精密度和线性好，试剂配制简单，值得进一步推广使用。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及医学检测及体外诊断领域，一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的方法。
技术介绍
：前白蛋白(Prealbumin，PA)，又称转甲状腺素蛋白(transthyretin)，分子量5.4万，由肝细胞合成，在电泳分离时，常显示在白蛋白的前方，其半衰期很短，仅约1.9天。因此，测定其在血浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性。除了作为一种灵敏的营养蛋白质指标，PA在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其血浓度下降。目前临床尚无公认的血清PA测定的参考方法，临床实验室测定血清PA含量的方法主要有免疫比浊法，包括免疫散射比浊法和免疫透射比浊法。近年来，比浊法测定技术因其具有简便、快速、自动、微量等特点，逐渐成为临床实验室测定血清PA的常规方法，又由于胶乳微球偶联技术的兴起及快速发展，渐渐使免疫比浊与胶乳微球结合，形成了普通免疫比浊技术的衍生，成为一种相较于免疫比浊法更简便快速，灵敏度更高，信号更强的检测方法，但该方法也存在其局限性，及偶联效果的不可控性，使得胶乳微球的利用率不高，因此，找到一种提升抗体与胶乳微球间偶联效果的方法，提高胶乳微球的利用率，增强反应效果是本领域亟需解决的技术问题。
技术实现思路
：鉴于以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的方法，所述的方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳微球颗粒。本专利技术的技术方案：将组合定向剂中的定向剂1与PA抗体结合，形成PA抗体复合物。将组合定向剂中的定向剂2与PA抗体复合物再结合。最后加入两种不同粒径的经活化的羧基胶乳微球进行偶联，形成PA胶乳颗粒。以此方法为基础制备检测试剂盒，试剂1包括缓冲液、稳定剂和防腐剂，试剂2包括PA胶乳微球、缓冲液、保护剂、助悬剂、稳定剂和防腐剂。本技术方案所述的定向剂1为N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)或长臂活化生物素(BCNHS)，更优选长臂活化生物素(BCNHS)。所述的定向剂2为链霉亲和素。本专利技术试剂盒所述试剂1与试剂2中的缓冲液包括但不限于Tris-HCL缓冲液，PBS缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或几种，更优选PBS缓冲液。PH范围为7.0-8.0，更优选PH7.5-8.0。本专利技术试剂盒所述试剂1中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选聚乙二醇8000与氯化钠，浓度比为2∶1。本专利技术试剂盒所述试剂1与试剂2中的防腐剂包括但不限于叠氮钠，proclin300，硫柳汞中的一种或几种。本专利技术试剂盒所述试剂2中的保护剂为EDTA。本专利技术试剂盒所述试剂2中的助悬剂包括但不限于乙二醇，丙三醇，麦芽糖，蔗糖中的一种或几种，更优选丙三醇。本专利技术试剂盒所述试剂2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选蔗糖。本专利技术中，包括PA胶乳颗粒的制备及PA检测试剂盒的制备。具体操作如下：PA胶乳颗粒的制备：1)定向剂1结合PA抗体取浓度为0.5-5μg/ml羊抗人前白蛋白单克隆抗体，与定向剂1：长臂活化生物素(BCNHS)用量比为1∶2(mg∶mg)，混合于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，按BCNHS与二甲基甲酰胺(DMF)投料比为40∶1(w/v)加入DMF，37℃恒温振荡反应60min后，通过superdex200层析分离去除多余BCNHS，PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒温振荡反应20min重悬，获得PA抗体复合物。2)定向剂2结合PA抗体复合物按定向剂2：链霉亲和素与PA抗体复合物的投料比为1∶2(w/v)混合于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，37℃恒温振荡反应30min，通过superdex200层析分离去除多余链霉亲和素，PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒温振荡反应30min重悬，获得链霉亲和素-PA抗体复合物。3)胶乳微球的活化取粒径分别为50nm-100nm(2.5％w/v)与200nm-300nm(5.0％w/v)的羧基聚苯乙烯胶乳微球，按颗粒比例为80∶20分别用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤后，重新溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，分别加入1％(w/v)碳化二亚胺(EDC)活化，37℃恒温振荡反应20min，离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤两次后，分别溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒温振荡反应30min重悬，获得活化的两种粒径的胶乳微球，。4)链霉亲和素-PA抗体复合物与胶乳微球偶联将步骤2)获得的链霉亲和素-PA抗体复合物按3-5∶1的体积比分别加入到步骤3)获得的两种粒径的活化胶乳微球中，37℃恒温振荡反应2h，用0.5％(w/v)赖氨酸封闭20min后，分别进行高速离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤三次，分别溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒温振荡反应30min重悬，最后将两种粒径的PA胶乳微球颗粒混合。PA检测试剂盒的制备：以上述优选材料配制试剂盒(液体双试剂，R1∶R2为3∶1)，浓度分别为以本专利技术方法为基础所配制的试剂盒，其检测方法为胶乳增强免疫比浊法，测试条件及参数如下：1)检测仪器：具有600nm波长、37℃恒温装置的生化分析仪。2)待测样本：新鲜不溶血血清，可2-8℃保存。3)具体检测程序：4)校准品的使用及曲线绘制方法：用2.0ml蒸馏水复溶，以蒸馏水对校准液进行倍比稀释，采用多点定标校准模式。5)计算结果样品中PA含量(mg/L)＝ΔAT/ΔAS×校准液浓度式中：ΔAT：以空白管吸光度为对照的样品管吸光度ΔAS：以空白管吸光度为对照的校准管吸光度本专利技术的优势在于：利用两种不同粒径羧基聚苯乙烯胶乳微球，在提升灵敏度的同时，具有较好的线性，提高了产品性能。利用组合定向剂提升了抗体与胶乳微球间偶联效果，提高了胶乳微球的利用率，增强反应效果。附图说明：图1为实施例1中的本专利技术线性相关曲线图，采用AU480全自动生化分析仪，对5个梯度浓度的试剂进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值均值。相关系数：r2＝0.9931，线性方程为：y＝0.9932x-0.3201。图2为实施例2中的本专利技术线性相关曲线图，采用AU480全自动生化分析仪，对5个梯度浓度的试剂进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值均值。相关系数：r2＝0.9952，线性方程为：y＝0.9941x+1.5590。图3为实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的方法，所述的方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的方法，所述的方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳颗粒。2.根据权利要求1所述的组合定向剂：定向剂1与定向剂2，其特征在于定向剂1为N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)或长臂活化生物素(BCNHS)，更优选长臂活化生物素(BCNHS)。所述的定向剂2为链霉亲和素。3.根据权利要求1所述的两种不同粒径的羧基胶乳微球，其特征在于粒径分别为50nm-100nm(2.5％w/v)与200nm-300nm(5.0％w/v)，颗粒比例为80∶20。4.以本发明方法为基础制备检测试剂盒，试剂1包括缓冲液、稳定剂和防腐剂，试剂2包括PA胶乳微球、缓冲液、保护剂、助悬剂、稳定剂和防腐剂。所述试剂1与试剂2中的缓冲液包括但不限于Tris-HCL缓冲液，PBS缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或几种，更优选PBS缓冲液。PH范围为7.0-8.0，更优选PH7.5-8.0。所述试剂1中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选聚乙二醇8000与氯化钠，浓度比为2∶1。所述试剂1与试剂2中的防腐剂包括但不限于叠氮钠，proclin300，硫柳汞中的一种或几种。所述试剂2中的保护剂为EDTA。所述试剂2中的助悬剂包括但不限于乙二醇，丙三醇，麦芽糖，蔗糖中的一种或几种，更优选丙三醇。所述试剂2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选蔗糖。5.PA胶乳颗粒的制备：1)定向剂1结合PA抗体取浓度为0.5-5μg/ml羊抗人前白蛋白单克隆抗体，与定向剂1∶长臂活化生物素(BCNHS)用量比为1∶2(mg∶mg)，混合于PBS缓冲液(200mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贤俊，郑蓓蕾，
申请(专利权)人：王贤俊，
类型：发明
国别省市：浙江;33