一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法技术

技术编号:14853426 阅读:237 留言:0更新日期:2017-03-18 20:27
一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,即唾液中Ethylidene-dG和Propano-dG的测定方法,包括采用OG-500唾液采集管收集唾液,对唾液进行DNA提取,DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标、还原剂NaBH3CN和DNA水解酶。水解液经Strata-X小柱固相萃取,收集洗脱液,室温下氮吹至干,复溶于甲醇水溶液,引入LC-MS/MS系统分析,可准确检测出Et-dG和Propano-dG的含量水平。本发明专利技术采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差,串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化,较好的提高了色谱分离过程,缩短了色谱分析的时间,减少了有机溶剂的消耗量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于唾液样本的理化检验
,主要涉及唾液中N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)和1,N2-丙醇-鸟嘌呤(Propano-dG)DNA加合物的测定
,具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)测定唾液中乙醛-DNA加合物的方法。
技术介绍
乙醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物。主要产生于有机物的不完全燃烧,如工业废气、卷烟烟气、机动车尾气等。活泼的醛基不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内亲核基团,如核酸中的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。乙醛形成的主要DNA加合物包括N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)和1,N2-丙醇-鸟嘌呤(Propano-dG),其中N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)在单核苷酸状态下不稳定,需要将其在DNA酶水解阶段还原为N2-乙基-鸟嘌呤(Et-dG)才能被检出。唾液是一种非侵入式的样本采集方式,对受试者不造成影响样本易获得,是现成可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的靶器官,相关研究表明唾液中DNA的损伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞,因其生命周期较短,唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况,唾液在检测卷烟和食品致癌物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。目前,关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多,主要有32P-后标记技术、酶联免疫技术(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。目前,在唾液中Ethylidene-dG和Propano-dG的分析方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS技术建立的唾液中乙醛-DNA加合物(Ethylidene-dG和Propano-dG)的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点,可用于唾液中乙醛-DNA加合物的同时定性定量分析。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的:一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,即Ethylidene-dG和Propano-dG的测定方法,包括以下具体步骤:a、唾液采集:用Oragene·DNA唾液采集器(OG-500)对人体唾液进行标准化采集。b、唾液DNA的提取:Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后,加入Oragene净化液,涡旋振荡,冰浴孵育10min;于室温下离心;移取上层清液于一新的微量离心管中,加入纯乙醇,轻轻震荡数秒;静置使DNA分子完全沉淀,离心并去上清液;加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用NanoDrop2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量,对于双链DNA一个吸收单位(OD)相当于50μg/mL。c、DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500μL的10mMTris-HCl/5mMMgCl2缓冲液(pH=7)中,加入30mgNaBH3CN,将Ethylidene-dG还原为Et-dG;加入20μL混合内标,加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ,在37℃中孵育2h,随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经Strata-X固相萃取,收集洗脱液液氮吹至干,复溶于100μL30%甲醇水溶液,即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态,通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为10ng/mL的[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG。d、标准工作液的配制:用甲醇分别配制不同浓度的Et-dG和Propano-dG标准工作溶液。e、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定,吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液,注入LC-MS/MS系统,得到线性回归方程,对样品待测液进行测定,测得分析物与内标峰面积的比值,代入一元线性回归方程,求得样品待测液中分析物的含量。色谱条件:选取ThermoAcclaimTMPolarAdvantageIIC18色谱柱(4.6×150mm,3μm),流动相体系选取A:0.01%甲酸甲醇和B:10mM乙酸铵水溶液,洗脱条件为梯度洗脱:0-2min:25%A,2-17min:35%A,17-25min:25%A;流速为0.38mL/min。分析时间为25min,进样量为5μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI),多反应监测正离子扫描方式;喷雾电压:5500V,离子源温度:550℃,气帘气的量为20psi,雾化气为70psi,干燥气为75psi,碰撞气为9psi,射入电压:10V,碰撞能:9eV,驻留时间:100ms。监测离子对为Et-dG:296.2→180.2定量离子对,296.2→117.2定性离子对;内标[15N5]Et-dG为271.2→155.2;Propano-dG:338.3→222.1定量离子对,338.3→117.2定性离子对;内标[15N5]Propano-dG为343.2→227.2。各分析物及内标的MRM参数见表1。整个分析过程由AppliedBiosystemsAnalystversion1.5.1软件来控制。表1多反应监测模式下分析物及其内标的MRM参数*为定量离子本专利技术方法的线性范围和检出限:将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS,得到标准工作曲线、线性回归方程以及相关系数。Et-dG和Propano-dG标准曲线的点为0.02,0.05,0.1,0.2,0.3,0.5,1.0和2.0ng/mL。目标物的线性良好,相关系数均大于0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限,目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限,三倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲线及定量限和检出限见表2。表2目标物的标准工作曲线及LOD和LOQ本专利技术方法加标回收率和重复性:采取唾液DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率,总共选取了三个添加水平,每个添加水平重复测定3次,得到的方法的回收率和重复性,结果见表3。目标物的回收率在88.4%-107.5%之间,RSD小于10%,证明方法的准确性和重复性结果较好。表3分析物的加标回收率和重复性本专利技术的方法克服了现有技术样品处理方法的不足,针对唾液中乙醛-DNA加合物的色谱条件进行了优化,并对LC-MS/MS的相关检测条件本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种唾液中乙醛‑DNA加合物的测定方法,即唾液中N2‑亚乙基‑鸟嘌呤(Ethylidene‑dG)和1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤(Propano‑dG)的测定方法,其特征在于:包括以下具体步骤:a、唾液采集:用Oragene·DNA唾液采集器(OG‑500)对人体唾液进行标准化采集;b、唾液DNA的提取:Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后,加入Oragene 净化液,涡旋振荡,冰浴孵育10 min;于室温下离心;移取上层清液于一新的微量离心管中,加入纯乙醇,轻轻震荡数秒;静置使DNA分子完全沉淀,离心并去上清液;加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块;用超纯水复溶DNA,用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量,对于双链DNA一个吸收单位(OD)相当于50 μg/mL;c、DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris‑HCl/5 mM MgCl2缓冲液中,加入30 mg NaBH3CN,将N2‑亚乙基‑鸟嘌呤(Ethylidene‑dG)还原成N2‑乙基‑鸟嘌呤(Et‑dG)来检测;加入20 μL混合内标,加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ,在37℃中孵育2h,随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h;水解液经Strata‑X固相萃取,收集洗脱液液氮吹至干,复溶于100 μL 30%甲醇水溶液,即为样品待测液;d、标准工作液的配制:用甲醇配制不同浓度的N2‑亚乙基‑鸟嘌呤(Ethylidene‑dG)、1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤(Propano‑dG)标准工作溶液;e、液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)测定,吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液,注入LC‑MS/MS系统,得到线性回归方程,对样品待测液进行测定,测得分析物与内标峰面积的比值,代入一元线性回归方程,求得样品待测液中分析物的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,即唾液中N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-
dG)和1,N2-丙醇-鸟嘌呤(Propano-dG)的测定方法,其特征在于:包括以下具体步骤:
a、唾液采集:用Oragene·DNA唾液采集器(OG-500)对人体唾液进行标准化采集;
b、唾液DNA的提取:Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后,加入Oragene净化
液,涡旋振荡,冰浴孵育10min;于室温下离心;移取上层清液于一新的微量离心管中,加入
纯乙醇,轻轻震荡数秒;静置使DNA分子完全沉淀,离心并去上清液;加入70%的乙醇水溶液
清洗DNA团块;用超纯水复溶DNA,用NanoDrop2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的
含量,对于双链DNA一个吸收单位(OD)相当于50μg/mL;
c、DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500μL的10mMTris-HCl/5mMMgCl2缓冲
液中,加入30mgNaBH3CN,将N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)还原成N2-乙基-鸟嘌呤
(Et-dG)来检测;加入20μL混合内标,加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ,在37℃中孵育2h,随后加
入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h;水解液经Strata-X固相萃
取,收集洗脱液液氮吹至干,复溶于100μL30%甲醇水溶液,即为样品待测液;
d、标准工作液的配制:用甲醇配制不同浓度的N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)、1,
N2-丙醇-鸟嘌呤(Propano-dG)标准工作溶液;
e、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定,吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液,注
入LC-MS/MS...

【专利技术属性】
技术研发人员:胡清源陈欢侯宏卫刘鲁娟张小涛朱欣潮张森
申请(专利权)人:国家烟草质量监督检验中心
类型:发明
国别省市:河南;41

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