本发明专利技术公开了产气荚膜梭菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及其使用方法。试剂盒包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液。本发明专利技术的引物特异性好，灵敏度高，具有极高的反应效率，大大节省了检测时间，且操作简单，无需昂贵的仪器，最低检验限可达11 CFU/Test。试剂盒具有近实时监控的潜力，且更利于长途运输，从而为偏远地区的基层检测工作提供便利。本发明专利技术可广泛应用于食品、饮料、饮用水等领域的实验室以及现场快速检测，有广阔的应用前景和良好的经济和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化产气荚膜梭菌核酸快速诊断试剂盒及其使用方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌曾称魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。产气荚膜梭菌广泛分布于人畜粪便、土壤、污水等外环境中，其产生的肠毒素是引起食物中毒的主要因素，被产气荚膜梭菌污染的水在加热后，其芽孢仍可在较高温度、长时间贮存的过程中生长、繁殖，最后进入肠道并产生肠毒素而引起中毒。产气荚膜梭菌是指能够指示水体已有粪便污染，并可能伴存有肠道病原菌的一类细菌，根据规定饮用天然矿泉水中不得检出产气荚膜梭菌，现可用于瓶装水中产气荚膜梭菌检验的传统生化方法有涂布法、多试管MPN法和滤膜法，为提高检测效率，也可用酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，进行快速检测和结果初筛。这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对目标菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。LAMP技术是2000年由日本研究人员Notomi等开发的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。LAMP用于快速检测无需复杂仪器，具有结果判读简单、灵敏度高、特异性好、检测范围广泛以及应用成本低的优点。在实际应用中，检测前均要配制相应的溶液反应体系，且其中成分较多，极易导致频繁操作引起的试剂污染、检测区间污染以及结果误差等，加之该反应体系中部分试剂需要冷冻储存，如所需的BstDNA聚合酶需严格在-20℃条件下保存，温度过高会影响其酶活性，造成检测试剂失效。因此对该试剂的高温长途运输以及现场应用等造成不便，也提高了相应成本。同时，当前该检测方法尚未在食品安全、医药等领域推广开来，尤其在水体的快速检测上，作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及。且市场上基于环介导恒温扩增技术的产气荚膜梭菌快速诊断试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。干粉型LAMP快速检测试剂盒开发的难点主要有以下几个：1)保持冻干过程中BstDNA聚合酶的活力基本不损失；2)设计出合适的引物；3)显色不够明显，难以区分结果。为了保持BstDNA聚合酶的活力，添加冻干保护剂是比较常规的选择，常用的冻干保护剂是海藻糖，但是其保护效果比较有限，比较难以保证产品质量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有产气荚膜梭菌检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种适于常温运输的基于LAMP技术的干粉化产气荚膜梭菌快速诊断试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足食品安全中饮用水的生产流通各个环节的快速检测的需求。本专利技术所采取的技术方案是：一种应用于水中产气荚膜梭菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、BstDNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：产气荚膜梭菌-F3：CTAGATATGAATGGCAAAGAGG产气荚膜梭菌-B3：AGATATCAGCATAAAAATCCTCA产气荚膜梭菌-FIP：GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTC-TATCTTGG产气荚膜梭菌-BIP：TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT产气荚膜梭菌-LF：CTCCAAAATAGTGCATAGCCTCT产气荚膜梭菌-LB：TGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAA。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为液体石蜡。一种水中产气荚膜梭菌的快速检测方法，包括如下步骤：1)取水样抽滤，滤膜置于产气荚膜梭菌增菌培养基中增菌培养；2)增菌培养完成后分离微生物，裂解后提取核酸；3)将复溶液加入冻干等温扩增剂中，使冻干等温扩增剂完全溶解，得到反应液；4)按等温扩增操作分别在不同管内的反应液中加入提取得到的样品核酸、阳性对照和阴性对照，反应结束后加入显色液，对结果进行判断。本专利技术的有益效果是：1)该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，便于常温运输，节约运输成本，临用前暴露于室温72小时后基本不影响使用效果。2)该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；3)该反应过程在等温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；4)反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至11CFU/Test；5)利用靶基因序列设计并筛选三对引物，特异性地识别靶序列上的八个独立区域，具有高度特异性，实现反应在30～45min内完成，高效而快速；6)通过反应前加入由钙黄绿素和氯化锰按照一定比例混合的显色液，可通过肉眼颜色变化或者荧光监测仪器对荧光图谱的变化对结果进行判读，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且避免反应后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用于水中产气荚膜梭菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、Bst DNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，其特征在于：冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。
【技术特征摘要】
1.一种应用于水中产气荚膜梭菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、BstDNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，其特征在于：冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。2.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于：冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3%~6%(w/v)海藻糖、0.01%-0.1%(w/v)甘氨酸、0.1%-1%牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。3.根据权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于：冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4%~5%(w/v)海藻糖、0.04%-0.07%(w/v)甘氨酸、0.4%-0.7%牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。4.根据权利要求1～3任意一项所述的快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3%TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。5.根据权利要求1～...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，万强，卢勉飞，周杨，曲晓莹，杨宁，蔡芷荷，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司，广东环凯微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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