一种肠球菌质谱库、建立方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种肠球菌质谱库、建立方法及用途。该肠球菌质谱库包含有16种肠球菌及各个肠球菌对应的MALDI‑TOF MS质谱图。通过常规分离鉴定方法得到上述菌株，并用16S rRNA鉴定确定为肠球菌，再通过MALDI‑TOF MS检测得到各个肠球菌的指纹图谱，采用得到的指纹图谱建立肠球菌质谱库。本发明专利技术通过对MALDI‑TOF‑MS建立的肠球菌数据库的补充和完善避免了漏检或假阳性结果的产生，弥补了目前肠球菌现有数据库信息的不足，为肠球菌种属的鉴定提供了全面、快速、准确的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肠球菌质谱检测
，具体涉及一种肠球菌质谱库、建立方法及用途。
技术介绍
肠球菌是人和动物胃肠道的正常菌群，异位寄生易导致呼吸道和泌尿生殖道等部位的感染，是医院感染的重要致病菌之一，同时作为废水中的优势菌群，也是食品和饮用水中粪便污染的指示菌。目前，国内外对肠球菌感染动物的报道主要以感染粪肠球菌、屎肠球菌居多，肠球菌感染猪仔能引起一种高热、皮下及实质脏器肿大、出血为特征的传染病，给养猪业造成了严重的经济损失。在药物防治肠球菌的同时，肠球菌对现有抗生素能产生不同程度的抗药性，其抗性基因通过食物链由动物传播给人或在其他细菌之间传递，这使得肠球菌快速准确的鉴定显得尤为重要，传统的肠球菌鉴定方法主要有革兰染色、细菌分离培养和生化试验等，但是这些鉴定方法的耗时长、鉴定范围有限，大大影响肠球菌的鉴定速度和准确性，对肠球菌的控制有一定程度的阻碍。基于辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）是近年来发展的用于病原微生物快速鉴定的一种方法。不同的细菌经过MALDI-TOFMS检测可以形成特异性的指纹图谱，将待测细菌的指纹图谱与标准图谱库进行比较，即可鉴定细菌种属。目前由于现有数据库的信息不足，容易漏检或造成假阳性，对于肠球菌的全面准确检测造成严重的制约。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种肠球菌质谱库及建库方法，该质谱库具有较为全面的MALDI-TOFMS检测数据库中的肠球菌的质谱图，能够对多种肠球菌进行快速、准确的检测，更加有利于肠球菌的早期防治；本专利技术还提供了上述肠球菌质谱库在肠球菌检测中的用途。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种肠球菌质谱库，所述的肠球菌为HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，及各个肠球菌对应的MALDI-TOFMS质谱图。所述的肠球菌质谱库，所述的肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26均是从病死猪的内脏中分离得到。所述肠球菌质谱库的建立方法包括以下步骤：（1）使用常规的分离鉴定方法获得肠球菌菌落样品；（2）向EP离心管A中加入去离子水；然后取分离的单个菌落至离心管中，混合均匀后，加入无水乙醇，混合均匀；（3）将步骤（2）混合均匀的混合液放入离心机中以10000~13000rpm的转速离心2~5分钟，静置，倒去上清；剩余的物质再次进行离心，在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，移去残余的上清液，将得到的沉淀在室温下干燥2~4分钟；（4）在步骤（3）干燥之后的沉淀中加入甲酸的水溶液，混合均匀；然后加入纯乙腈，混合均匀后在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，吸取上清液置于另一新的离心管B中；（5）移取步骤（4）所述离心管B中的上清液1μl置于MALDI的靶板上，每个样品做三个平行孔，在室温下晾干，然后加上1μlHCCA基质液覆盖样品，室温晾干后上机，进行数据图谱的采集；（6）分别取等体积的标准肽溶液与HCCA基质液进行混合，然后取1μl混合液置于MALDI靶板上作为标准品，室温晾干，待完全干燥后进行检测，每个标准品各做三个平行孔，作为仪器的校准品；（7）在检测器中放入已点好样品和校准品的靶板，打开FlexControl，校准仪器，首先用校准品进行系统误差的校正，然后再进行待测样本的质谱分析，通过Biotyper软件进行分析鉴定，得到每个样品的指纹图谱；（8）建立数据库：将步骤（7）得到的指纹图谱进行保存，然后用MALDIBiotyper打开对图谱的质量进行评估，除去低质量的图谱（即重复性的图谱），完成建库过程，得到自建库。步骤（8）所述自建库的建立流程如下：打开MALDIBiotyper软件，选中全部用于建库的文件，点击鼠标右键，选择CreatMSP输入正确的菌名，生成MSP之后，软件右边数据库界面中的UnassignedMSPs由（0/0）变成（1/1），这说明已经将建好的MSP放进了临时数据库内；然后需要将自建的MSP加入到Projects自建库里，选中软件右边界面Projects，点击编辑按钮，开启编辑菜单，在选中的Projects节点上点击鼠标右键，出现NewNode，在此节点的下一级建立新的节点，将自建的数据库名输入，选取未分配的临时数据库添加到自建库中，完成数据库的自建。所述肠球菌质谱库的建立方法，其中步骤（2）所述的EP离心管为1.5ml，所述EP离心管与去离子水的体积比为5：1；所述去离子水、无水乙醇与所取菌落的用量比为0.3ml：0.9ml：（5~10）mg。所述肠球菌质谱库的建立方法，步骤（4）所述加入的70%的甲酸水溶液与步骤（1）所述加入的去离子水的体积比为1：6，所述加入的70%的甲酸水溶液与纯乙腈的体积比为1：1。上述肠球菌质谱库在细菌种属鉴定中的应用。上述肠球菌质谱库的建立方法在细菌种属鉴定中的应用。附图说明图1为本专利技术所得自建库中肠球菌HN1，HN4，HN5，HN8，HN9，HN10，HN12，HN18的指纹图谱；图2为本专利技术所得自建库中肠球菌HN6，HN11，HN13，HN16，HN17，HN19，HN22，HN26的指纹图谱；图3为肠球菌标准菌株ATCC33186的离子峰图谱；图4为标准肠球菌ATCC33186的可信度分值；图5为疑似肠球菌YC1、YC2的MALDI-TOFMS检测结果图，图中：上图为疑似肠球菌YC1的图谱，下图为疑似肠球菌YC2的图谱；图6为疑似肠球菌YC1、YC2与自建库和布鲁克图库的可信度分值，图中：左图为疑似肠球菌YC1的结果，右图为疑似肠球菌YC2的结果。与现有技术相比，本专利技术具有以下积极有益效果（1）本专利技术所述的由肠球菌指纹图谱建立的数据库用于肠球菌种属的鉴定，能够快速、准确的确定肠球菌所属种类，省时、省力；（2）本专利技术通过对HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26肠球菌菌种的测定及数据库的建立，对MALDI-TOF-MS建立的肠球菌数据库进行了补充和完善；尽管MALDI-TOF-MS用于微生物分类与鉴定的研究已有很多，但是针对肠球菌研究的报道却不多见，尤其是肠球菌标准菌库的建立更是空白，目前由于肠球菌现有数据库信息不足，容易漏检或者造成假阳性，本专利技术通过对MALDI-TOF-MS建立的肠球菌数据库的补充和完善避免了漏检或假阳性结果的产生，弥补了目前肠球菌现有数据库信息的不足。具体实施例下面通过具体实施例对本专利技术进行更加详细的说明，但是并不用于限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为市售试剂。实施例1肠球菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：1）细菌的分离培养在无菌条件下取病死猪的血液、肝、脾、肾、淋巴结组织的典型病料直接接种于营养琼脂平板和脑心萃取液琼脂平板（BHIA）上，在37℃温箱内培养24小时；在BHIA琼脂平板上生长良好，37℃条件下培养24小时即能长出灰白色、不透明、圆形、微凸、湿润、表面光滑、边缘齐整的露本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠球菌质谱库，其特征在于，所述的肠球菌质谱库包括肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，及各个肠球菌对应的MALDI‑TOF MS质谱图。

【技术特征摘要】
1.一种肠球菌质谱库，其特征在于，所述的肠球菌质谱库包括肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，及各个肠球菌对应的MALDI-TOFMS质谱图。2.根据权利要求1所述的肠球菌质谱库，其特征在于，所述的肠球菌HN1，HN4，HN5，HN6，HN8，HN9，HN10，HN11，HN12，HN13，HN16，HN17，HN18，HN19，HN22，HN26，均是从病死猪的内脏中分离得到。3.一种权利要求1所述肠球菌质谱库的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）使用常规的分离鉴定方法获得肠球菌菌落样品；（2）向EP离心管A中加入去离子水；然后取分离的单个菌落至离心管中，混合均匀后，加入无水乙醇，混合均匀；（3）将步骤（2）混合均匀的混合液放入离心机中以10000~13000rpm的转速离心2~5分钟，静置，倒去上清；剩余的物质再次进行离心，在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，移去残余的上清液，将得到的沉淀在室温下干燥2~4分钟；（4）在步骤（3）干燥之后的沉淀中加入质量浓度为70%的甲酸水溶液，混合均匀；然后加入纯乙腈，混合均匀后在10000~13000rpm的转速下离心2~5分钟，吸取上清液置于另一新的离心管B中；（5）移取步骤（4）所述离心管B中的上清液1μl置于MA...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗丽，王海花，冯艳红，
申请(专利权)人：河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：河南;41