人工湿地大颗粒基质表面微生物DNA的定性和/或定量提取方法技术

本发明专利技术公开了一种人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，是以人工湿地填充的大颗粒基质为材料，采用摇床震荡的方法洗脱大颗粒基质表面生物膜并离心获得沉淀，将沉淀用脱腐缓冲液和氯化钙溶液进行脱腐处理，再经SDS‑溶菌酶法裂解细胞，氯仿抽提，异丙醇沉淀获得DNA。与未经预处理及现有的试剂盒提取方法相比，本发明专利技术提取的人工湿地基质生物膜总DNA浓度高、纯度高、完整性好，微生物多样性信息量损失小，可直接用于PCR、实时定量PCR和DGGE实验分析。本发明专利技术具有提取成本低、耗时短等优点，减少了样品处理过程中的污染几率以及冻融造成的DNA损失，解决了直接提取人工湿地大颗粒基质总DNA获得率低、纯度低、多样性信息量少的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物分子生态学
，更具体地，涉及一种人工湿地砾石表面微生物DNA的定性和/或定量提取方法。
技术介绍
生物量和群落结构作为人工湿地的两大重要特性，它们在湿地内部的分布特征与污染物在湿地内部的降解行为息息相关。随着分子生物学的发展及其在生态学中的应用，特别是生态学方向宏基因组学方法的建立及发展，培养手段已远远不能满足对人工湿地大通量的物种信息需要。由此，研究便指向了包括培养及非培养微生物在内的整个环境基因组DNA上，通过高通量测序及qPCR等分子生物学技术手段，以这些更为准确的方式获得涵盖整个微生物群落的信息。而这些信息获得的前提，是需要提供足够质量、纯度和完整的基因组DNA，如华大基因有限公司的宏基因组测序送样要求为：总量≥1.5μg，OD260/280在1.8至2.0之间，OD260/280＞1.5，且电泳检测条带无明显降解。当需要使用qPCR对细菌、古菌或氨氧化细菌等进行定量时，需要基因组DNA能够进行PCR反应，而且需要定量提取基因组DNA，数据重复性要好，以便准确定量基质中微生物的含量。土壤、沉积物、淤泥等环境样品中含有大量的腐殖质，这是导致样品DNA提取效率及品质降低的主要因素之一，因此国内逐渐出现了各种可有效脱腐的DNA提取技术，以期从富含腐殖质的样品中有效的获得高品质的DNA。申请号为201010573017.8的中国专利申请公开了一种淡水沉积物总DNA的提取方法，申请号为201110090363.5的中国专利申请公开了一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒，申请号为201110178774.X的中国专利申请公开了一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，申请号为201210137580.X的中国专利申请公开了一种从湖泊沉积物样品中提取纯化总DNA的高效方法，申请号为201410581883.X的中国专利申请公开了基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法等等。以上专利所公开的方法仅限于直接提取颗粒极细的环境样品，并未提及粗糙且表面不均一的大颗粒基质样品，尤其是如何对大颗粒基质样品表面微生物DNA进行定量的提取。人工湿地中为了防止系统堵塞，常会使用大颗粒砾石、火山石、沸石等基质作为床体填料，这些大颗粒基质的单粒重往往超过0.5g，无法像土壤、沉积物和淤泥那样使用微量土壤DNA提取试剂盒提取DNA，而且试剂盒价格昂贵，对于大批量样品的提取并非经济可行。因此，需要研制适用于大颗粒基质表面微生物DNA提取的高效、快速、经济而且可批量化进行的方法，解决常规方法难以直接提取大颗粒基质样品表面微生物DNA、提取的DNA存在腐殖质等PCR抑制物以及定量不准确、DNA产量低的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有DNA提取技术难以直接获取大颗粒基质表面微生物DNA的不足之处，建立一种成本低、快速化并定量的提取人工湿地大颗粒基质表面微生物DNA的方法，不仅可以实现定性还可以定量检测分析。该方法所获得的DNA可直接作为PCR的模板，用于基因定量检测和高通量测序，开展人工湿地基质生物膜生物量和群落结构分析。本专利技术目的通过以下技术方案予以实现：提供一种人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，该方法以人工湿地填充的大颗粒基质为材料，采用摇床震荡的方法洗脱砾石表面生物膜并离心获得沉淀，将沉淀用脱腐缓冲液和氯化钙溶液进行脱腐处理，再经SDS-溶菌酶法裂解细胞，氯仿抽提，异丙醇沉淀获得DNA。使用该方法获得的DNA，其OD260/280和OD260/280都在1.8左右。经本专利技术方法获得的DNA不需要稀释和纯化即可直接用于PCR反应。所述大颗粒基质为材料包括砾石、火山石或沸石。本专利技术方法所述提取方法包括基质生物膜洗脱和脱腐预处理和DNA抽提步骤。具体地，其具体步骤如下：S1.基质生物膜洗脱和脱腐预处理：S11.采集大颗粒基质，加入无菌生理盐水，振荡洗脱大颗粒基质表面生物膜，得到悬浊液；S12.吸取步骤S11所得悬浊液于适宜体积的无菌离心管中，离心处理后，弃净上清，继续加入悬浊液，再次离心处理后，待管内所得沉淀达到检测所设定的沉淀质量后，将含沉淀的离心管保存于-20℃冰箱备用；S13.取出保存有沉淀的无菌离心管，在常温下放置解冻，将无菌石英砂加入沉淀中，向沉淀中加入脱腐缓冲液并涡旋混匀，离心处理后弃上清，所得沉淀进行下一步骤DNA提取操作。所述脱腐缓冲液的组成为100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、100mmol/LNa2P2O7、100mmol/LNa2EDTA(pH8.0)，1％PVP，100mmol/LNaCl，0.05％TritonX-100；所述脱腐缓冲液的pH值为8.0。S2.DNA提取：S21.向步骤S13所得沉淀中加入0.5mol/L的氯化钙，涡旋混匀，离心处理后弃上清，得沉淀；S22.向步骤S21所得沉淀中加入0.05mol/L的草酸钠，涡旋混匀，离心处理后弃上清，得沉淀；S23.向步骤S22所得沉淀中加入DNA提取液和溶菌酶，涡旋混匀，摇床处理；所述DNA提取液的组成为100mMTris-HCl、1.5mol/LNaCl和1％CTAB，pH值为8.0；所述溶菌酶的浓度为100mg/mL；S24.短暂离心后加入100uL20％SDS，涡旋混匀，水浴处理，间隔颠倒摇匀数次；S25.离心处理后收集中间液相层并重复洗涤沉淀一次；S26.向收集的上清液体中加入等体积氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心处理后收集上部的液相层；所述氯仿与异戊醇的混合体积比例为24:1；S27.向收集的液相层中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠和0.6倍体积的异丙醇，-20℃放20min；S28.离心处理后弃上清；向沉淀中加入1mL70％乙醇洗涤，再次离心处理，弃上清，重复洗一次，得沉淀；S29.将步骤S28中所得沉淀，烘干并溶解即获得DNA溶液。优选地，步骤S11所述的生理盐水的浓度为0.85％。优选地，步骤S11所述大颗粒基质和无菌生理盐水的质量体积比为1g：1mL。优选地，步骤S11所述振荡洗脱是在无菌聚乙烯瓶中进行操作。优选地，步骤S11所述振荡是于15℃、置于摇床后以225rpm的转速摇匀3h，可以充分地洗脱大颗粒基质(砾石)的表面生物膜。优选地，步骤S12所述离心处理是在4℃、12000rp条件下离心处理10min。优选地，步骤S13所述无菌石英砂的粒径约为1mm。优选地，步骤S13所述离心处理是在室温、12000rp条件下离心处理5min。优选地，步骤S13所述脱腐缓冲液按以下步骤制备：100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、100mmol/LNa2P2O7、100mmol/LNa2EDTA(pH8.0)、1％PVP、100mmol/LNaCl、0.05％TritonX-100、4％脱脂奶粉，pH8.0，用0.44μm纤维素膜抽滤，再用0.22μm无菌滤头抽滤。优选地，步骤S21所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心5min。优选地，步骤S22所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心5min。优选地，步骤S23所述摇床处理的条件是在37℃、225rpm下处理30min；优选地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，其特征在于，是以人工湿地填充的大颗粒基质为材料，采用摇床震荡的方法洗脱大颗粒基质表面生物膜并离心获得沉淀，将沉淀用脱腐缓冲液和氯化钙溶液进行脱腐处理，再经SDS‑溶菌酶法裂解细胞，氯仿抽提，异丙醇沉淀获得DNA。

【技术特征摘要】
1.一种人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，其特征在于，是以人工湿地填充的大颗粒基质为材料，采用摇床震荡的方法洗脱大颗粒基质表面生物膜并离心获得沉淀，将沉淀用脱腐缓冲液和氯化钙溶液进行脱腐处理，再经SDS-溶菌酶法裂解细胞，氯仿抽提，异丙醇沉淀获得DNA。2.根据权利要求1所述人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，其特征在于，所述大颗粒基质为材料包括砾石、火山石或沸石。3.根据权利要求1所述人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，其特征在于，所述洗脱大颗粒基质表面生物膜是按以下步骤进行：将大颗粒基质加入生理盐水中，置于摇床，温度调至15℃，并以225rpm的转速摇匀3h。4.根据权利要求1所述人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，其特征在于，所述脱腐缓冲液的组成为100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、100mmol/LNa2P2O7、100mmol/LNa2EDTA(pH8.0)，1％PVP，100mmol/LNaCl，0.05％TritonX-100；所述脱腐缓冲液的pH值为8.0。5.根据权利要求1至4任一项所述人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，其特征在于，定性提取的方法包括以下步骤：S1.基质生物膜洗脱和脱腐预处理；S2.DNA提取；其中，步骤S1包括以下步骤：S11.采集大颗粒基质，加入无菌生理盐水，振荡洗脱大颗粒基质表面生物膜，得到悬浊液；S12.吸取步骤S11所得悬浊液于适宜体积的无菌离心管中，离心处理后，弃净上清，继续加入悬浊液，再次离心处理后，待管内所得沉淀达到检测所设定的沉淀质量后，将含沉淀的离心管保存于-20℃冰箱备用；S13.取出保存有沉淀的无菌离心管，在常温下放置解冻，将无菌石英砂加入沉淀中，向沉淀中加入脱腐缓冲液并涡旋混匀，离心处理后弃上清，所得沉淀进行下一步骤DNA提取操作；所述脱腐缓冲液的组成为100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、100mmol/LNa2P2O7、100mmol/LNa2EDTA(pH8.0)，1％PVP，100mmol/LNaCl，0.05％TritonX-100；所述脱腐缓冲液的pH值为8.0；步骤S2包括以下步骤：S21.向步骤S13所得沉淀中加入0.5mol/L的氯化钙，涡旋混匀，离心处理后弃上清，得沉淀；S22.向步骤S21所得沉淀中加入0.05mol/L的草酸钠，涡旋混匀，离心处理后弃上清，得沉淀；S23.向步骤S22所得沉淀中加入DNA提取液和溶菌酶，涡旋混匀，摇床处理；所述DNA提取液的组成为100mMTris-HCl、1.5mol/LNaCl和1％CTAB，pH值为8.0；所述溶菌酶的浓度为100mg/mL；S24.短暂离心后加入100uL20％SDS，涡旋混匀，水浴处理，间隔颠倒摇匀数...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨扬，黄文达，陶然，郭菁菁，满滢，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44