本发明专利技术公开了一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法及该霉应用，分离方法为：采集罹病的红花醡浆草，水冲洗后在病健交界处剪大小为5×5mm的组织；将组织依次浸入酒精和质量分数为5％的次氯酸钠溶液中，最后用灭菌水冲洗3次，并放在PDA培养基上培养；将不同形态的菌落分别转接至新的PDA培养基上进行培养并重复纯化；本发明专利技术通过提出从发病的红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法，并通过设计引物，结合形态学特征鉴定该菌为高粱茎点霉；采用该菌进行对红花醡浆草的防效实验，检测得出该菌在浓度1×106‑1×109conidia/ml时对红花醡浆草防效在80％以上，证明从罹病红花醡浆草中提取得到的高粱茎点霉能有效应用于对红花醡浆草的防治领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体是一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉(Phomasorghina)的方法及应用。
技术介绍
红花醡浆草俗称铜锤草、四瓣菜、系醡浆草科多年生宿根性阔叶杂草，原产美洲热带地区，为全世界分布的一种恶性杂草，我国南北各地均有分布，贵州主要产于贵阳和独山，在我国最初引进作为观赏植物，现在也成为农田恶性杂草；红花醡浆草本身具有极强的繁殖能力和生长能力，主要以地下鳞茎繁殖，经统计，红花醡浆草危害严重的地块可使辣椒减产50％-60％，玉米减产30-50％，花生、大豆等低矮作物减产50％-75％，受害最为严重的是露地西瓜，损失达50-85％，甚至有些地块达到100％，防治红花醡浆草已成为旱地杂草防除的重要工作，鉴于有关红花醡浆草发生规律与防治方面的专门研究报道甚少，所以对于红花醡浆草发生消长规律、生长发育及繁殖特性等进行系统的研究，为防治红花醡浆草提供理论依据是目前迫切需要解决的问题。所以针对上述问题，本专利技术提供了一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法及该霉的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法及该霉的应用来防治旱地作物免受红花醡浆草侵害，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉(Phomasorghina)的方法，包括以下步骤：1)分离：1.1)采集罹病的红花醡浆草，先用自来水冲洗表面；在病健交界处剪大小5×5mm组织若干块；1.2)将步骤1.1)中剪切的组织依次浸入酒精中30s，浸入质量分数为5％的次氯酸钠溶液中45s，最后用灭菌水冲洗3次，并放在PDA培养基上在28℃培养箱中黑暗培养5天；1.3)将步骤1.2)中培养得到的不同形态的菌落分别转接至新的PDA培养基上进行培养纯化，并重复纯化2-3次；2)形态学鉴定：将步骤1.3)中纯化好的菌落用直径0.5cm的打孔器打下菌饼放在PDA培养基上，在28℃培养箱中黑暗培养7天，每天观察菌落特征，包括形态、颜色、质地，菌丝和分子孢子形态；3)分子生物学鉴定：采样试剂盒提取步骤2)中菌落的DNA，首先使用ITS通用引物,进行PCR，PCR后进行胶回收测序，测序结果提交NCBI，Genbank号分别为：KX758542；根据ITS测序结果为茎点霉属(Phomasp.)，根据该属的保守序列设计引物LSU和TUB设计2对引物，进行PCR，PCR后进行胶回收测序，测序结果提交NCBI，Genbank号分别为：、KY000557、KY000558。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤2)中，菌落形态为白色、辐射状，致密；菌丝透明无隔；分生孢子为单孢、椭圆形；根据步骤2)中的形态学鉴定和步骤3)中的分子生物学鉴定，得出所述菌种为半知菌纲(FungiImperficti)，壳霉目(Sphaeropsicaceae)，茎点霉属(Phomasp.)高粱茎点霉(Phomasorghina)。以分离的纯培养菌的分生孢子悬浮液接种至幼苗期的红花醡浆草，接种后2d出现明显的水浸状斑点，之后叶片退绿发白，切取发病组织重新分离培养，所得的分离物与原接种病原物一致，完成了柯霍氏法则的验证，证明分离物是红花醡浆草的致病菌。研究其转化型发现该菌对甘蔗、水稻、小麦、玉米等作物安全，对牛筋草和马唐没有致病性，红花醡浆草致病性强，显示出对该菌有较大潜力开发成除草生防菌。培养方法：该菌可以用下列培养基进行培养，并诱导产生分生孢子，1、PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L；2、红花醡浆草浸汁培养基：红花醡浆草叶片(晒干、粉碎、过200目筛)200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L；3、玉米粉培养基玉：米粉30g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L4、燕麦培养基：燕麦片30g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L。作为本专利技术再进一步的方案：对于利用该方法得到的高粱茎点霉，其应用为利用高粱茎点霉(Phomasorghina)进行红花醡浆草防效实验，实验步骤如下：1)将高粱茎点霉在PDB培养基28℃条件下发酵7或14天，取发酵液喷雾处理红花醡浆草；2)可用用分生孢子或菌丝体水溶液处理红花醡浆草叶片，浓度1×106-109conidia/ml，或者将分生孢子与各类辅助剂混合配置成悬浮液；经检测，高粱茎点霉对红花醡浆草防效在80％以上，显示高粱茎点霉有效用于红花醡浆草的防治。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种从发病的红花醡浆草上分离出高粱茎点霉(Phomasorghina)的方法，并通过形态学鉴定该菌在PDA上的形态特征：分生孢子器大小150-220μm，分子孢子大小3.5-8.5×2.2-3.0μm，通过分子生物学鉴定，DNA提取对ITS，LSU和TUB测序，结合形态学特征鉴定该菌为高粱茎点霉(Phomasorghina)；该菌的培养条件适应性广，在pH4-9和温度15-35℃之间均可生长，培养基成本廉价易获得，孢子在15-35℃之间均可萌发，对大部分作物安全，进一步的，通过对红花醡浆草防效实验，检测得出该菌在浓度1×106-1×109conidia/ml时对红花醡浆草防效在80％以上，证明从罹病红花醡浆草中提取得到的高粱茎点霉能有效应用于对红花醡浆草的防治领域。附图说明图1为本专利技术高粱茎点霉(Phomasorghina)孢子在光学显微镜下结构示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1请参阅图1，一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉(Phomasorghina)的方法，包括以下步骤：1)取样：2015年3月在广西上林县农田样品采集罹病的红花醡浆草，用塑料袋保存带回实验室备用；2)分离：2.1)样品前处理：先用自来水冲洗样品表面，接着使用灭菌剪刀剪切病健交界处组织，大小5mm*5mm，用镊子转移到带有75％乙醇灭菌的离分杯中；2.2)样品处理：在装有无水乙醇的分离杯中浸泡30s，转移到装有质量分数为5％的次氯酸钠溶液灭菌分离杯中，浸泡45s，然后用灭菌水冲洗3次，转移到PDA培养基上；2.3)组织培养：将PDA培养基放置在28℃条件下的隔水式培养箱中，黑暗培养5天；2.4)纯化：挑取不同形态的菌落转接至新的PDA培养基上，在28℃条件下的隔水式培养箱中，黑暗培养5天进行分离和纯化，并重复纯化2-3次；3)形态学鉴定：将纯化好的菌落用直径0.5cm的打孔器打下菌饼放在PDA培养基上，在28℃条件下于隔水式培养箱中黑暗培养7天，每天观察菌落特征，包括形态、颜色、质地，菌丝和分子孢子形态；记录菌落颜色、菌落质地，并用直尺测量生长速度；培养到第7天时，用接种针挑取菌丝和孢子在尼康Ni-E光学显微镜下检测菌丝、子囊和孢子特征：菌落形态白色、辐射状，致密；菌丝透明无隔；分生孢子为单孢、椭圆形；本专利技术高粱茎点霉(Phomasorghina)在光学显微镜下结构特征如附图1所示；4)分子生物学鉴定：采样试剂盒提取菌落的DNA，首先使用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离：1.1)采集罹病的红花醡浆草，先用自来水冲洗表面；在病健交界处剪大小5×5mm组织若干块；1.2)将步骤1.1)中剪切的组织依次浸入酒精中30s，浸入质量分数为5％的次氯酸钠溶液中45s，最后用灭菌水冲洗3次，并放在PDA培养基上在28℃培养箱中黑暗培养5天；1.3)将步骤1.2)中培养得到的不同形态的菌落分别转接至新的PDA培养基上进行培养纯化，并重复纯化2‑3次；2)形态学鉴定：将步骤1.3)中纯化好的菌落用直径0.5cm的打孔器打下菌饼放在PDA培养基上，在28℃培养箱中黑暗培养7天，每天观察菌落特征，包括形态、颜色、质地，菌丝和分子孢子形态；3)分子生物学鉴定：采样试剂盒提取步骤2)中菌落的DNA，首先使用ITS通用引物,进行PCR，PCR后进行胶回收测序，测序结果提交NCBI，Genbank号分别为：KX758542；根据ITS测序结果为茎点霉属(Phoma sp.)，根据该属的保守序列设计引物LSU和TUB设计2对引物，进行PCR，PCR后进行胶回收测序，测序结果提交NCBI，Genbank号分别为：KY000557、KY000558。...
【技术特征摘要】
1.一种从红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离：1.1)采集罹病的红花醡浆草，先用自来水冲洗表面；在病健交界处剪大小5×5mm组织若干块；1.2)将步骤1.1)中剪切的组织依次浸入酒精中30s，浸入质量分数为5％的次氯酸钠溶液中45s，最后用灭菌水冲洗3次，并放在PDA培养基上在28℃培养箱中黑暗培养5天；1.3)将步骤1.2)中培养得到的不同形态的菌落分别转接至新的PDA培养基上进行培养纯化，并重复纯化2-3次；2)形态学鉴定：将步骤1.3)中纯化好的菌落用直径0.5cm的打孔器打下菌饼放在PDA培养基上，在28℃培养箱中黑暗培养7天，每天观察菌落特征，包括形态、颜色、质地，菌丝和分子孢子形态；3)分子生物学鉴定：采样试剂盒提取步骤2)中菌落的DNA，首先使用ITS通用引物,进行PCR，PCR后进行胶回收测序，测序结果提交NCBI，Genbank号分别为：KX758542；根据ITS测序结果为茎点霉属(Phomasp.)，根据该属的保守序列设计引物LSU和TUB设计2对引物，进行PCR，PCR后进行胶回收测序，测序结果提交NCBI，Genbank号分别为：KY000557、KY000558。2.根据权利要求1所述的从红花醡浆草上分离高粱茎点霉的方法，其特征在于，所述步骤2)中，菌落形态为白色、辐射状，致密；菌丝透明无隔；分生孢子为单孢、椭圆形；根据步骤2)中的形态学鉴定和步骤3)中的分子生物...
【专利技术属性】
技术研发人员：王彦辉，陈小林，马永林，罗韬，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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