一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法及同时定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法及定量检测方法，1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；2)以石墨化炭黑材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液；3)将所得植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液通过分析仪器采集响应数据，进而采用内标法同时定量测定植物样品中的多种内源性植物激素。本发明专利技术方法简单、快速、省溶剂、易操作，可实现低含量的内源性植物激素的富集纯化，并实现同时定量检测，方法简单快速，准确性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法及同时定量检测方法，属于分析化学领域。
技术介绍
植物激素在植物生长、发育的各个阶段发挥着及极其重要的作用。同时、准确的定量植物组织中多种植物激素，有助于了解植物激素的生理功能和调控网络。但是，由于植物提取液中基质复杂、含量极低且化学性质各异，使得同时测定植物样品中多种植物激素具有较大困难。目前已报道的植物中多种植物激素的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、固相微萃取、磁固相萃取和液相色谱纯化方法等，这些方法前处理过程多数会带来溶剂消耗大和成本高等问题。此外，由于化学性质差异较大，上述前处理方法会不可避免地造成回收率低，检测灵敏度差，不利于实际样品中的检测。现有专利ZL201210486507.3和ZL201310131422.8，是基于油菜素甾醇(BRs)的分析检测。由于BRs类激素化学结构性质相似，且都含有顺式羟基，针对这一类物质的性质，有了上述专利所述的前处理方案。但是对于化学性质不同于油菜素甾醇(BRs)的其他类植物激素，用上述方案则无法实现。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法及同时定量检测方法，可同时实现低含量的多种内源性植物激素的富集纯化，并实现同时定量检测，方法简单快速，准确性高。本专利技术为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法，主要步骤如下：1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；2)以石墨化炭黑材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液，从而实现植物样品中多种内源性植物激素的样品前处理。按上述方案，所述植物样品为幼苗期的水稻，分蘖期的水稻，灌浆期的叶片和花穗，成熟期的叶片和花穗，以及水稻的根，拟南芥的根、茎、叶、花和角果等等植物样品。按上述方案，所述植物样品为粉末状，如可以预先采用液氮冷冻后研磨至粉末状。按上述方案，所述内源性植物激素的种类主要包括生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、茉莉酸类、水杨酸类以及脱落酸类的内源性植物激素等等。按上述方案，所述内源性植物激素主要包括吲哚-3-乙酸(IAA)，吲哚-3-丁酸(IBA)，脱落酸(ABA)，水杨酸(SA)，反式玉米素(tZ)，反式玉米素核苷(tZR)，顺式玉米素(cZ)，顺式玉米素核苷(cZR)，异戊烯基腺嘌呤(iP)，异戊烯基腺嘌呤核苷(iPR)，双氢玉米素(DZ)，双氢玉米素核苷(DZR)，反式玉米素-7-糖苷(tZ7G)，反式玉米素-9-糖苷(tZ9G)，顺式玉米素-9-糖苷(cZ9G)，顺式玉米素-O-糖苷(cZOG)，双氢玉米素-7-糖苷(DZ7G)，双氢玉米素-9-糖苷(DZ9G)，双氢玉米素-O-糖苷(DZOG)，异戊烯基腺嘌呤-7-糖苷(iP7G)，异戊烯基腺嘌呤-9-糖苷(iP9G)，2-苄硫基异戊烯基腺嘌呤(2BSiP)，2-氯反式玉米素(2CltZ)，2-甲硫基反式玉米素(2MeStZ)，2-甲硫基顺式玉米素(2MeScZ)，2-甲硫基反式玉米素核苷(2MeStZR)，2-甲硫基顺式玉米素核苷(2MeScZR)，2-甲硫基异戊烯基腺嘌呤(2MeSiP)，2-甲硫基异戊烯基腺嘌呤核苷(2MeSiPR)，赤霉素1(GA1)，赤霉素3(GA3)，赤霉素4(GA4)，赤霉素5(GA5)，赤霉素6(GA6)，赤霉素7(GA7)，赤霉素8(GA8)，赤霉素9(GA9)，赤霉素12(GA12)，赤霉素13(GA13)，赤霉素15(GA15)，赤霉素19(GA19)，赤霉素20(GA20)，赤霉素23(GA23)，赤霉素24(GA24)，赤霉素29(GA29)，赤霉素34(GA34)，赤霉素44(GA44)，赤霉素51(GA51)，赤霉素53(GA53)，茉莉酸(JA)，茉莉酸-异亮氨酸(JA-leu)，茉莉酸-苯丙氨酸(JA-phe)，12-羟基茉莉酸(12OHJA)，12-氧代植二烯酸(OPDA)，脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)等等中的一种或多种。按上述方案，根据需要加入相应的同位素内标，主要为[2H2]IAA，[2H6]ABA，二氢茉莉酸(2H-JA)，[2H4]SA，[2H2]GA1，[2H2]GA4，[2H2]GA5，[2H2]GA6，[2H2]GA7，[2H2]GA8，[2H2]GA9，[2H2]GA12，[2H2]GA15，[2H2]GA20，[2H2]GA24，[2H2]GA34，[2H2]GA44，[2H2]GA51，[2H2]GA53，[2H5]tZ，[15N5]cZ，[2H5]tZ7G，[2H5]tZ9G，[2H3]DZ，[2H5]DZ9G，[2H7]DZOG，[2H6]iP，[2H6]iP9G，[2H5]tZR，[2H3]DZR，[2H6]iPR等等。待测多种内源性植物激素与之相对应的内标如表1所示。按上述方案，所述溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸等中的一种或几种按任意比例的混合物。溶剂的作用是：在有效地提取出分析物的前提下，尽可能少地提取杂质等干扰物。按上述方案，所述溶剂提取的温度为-25～-15℃，时间范围为6～12h。按上述方案，所述加入石墨化炭黑材料后除杂的温度为室温，时间为3min或者大于3min。除杂过程中可以采用涡旋或者振荡等方式以保证除杂均匀充分。按上述方案，步骤2)中优选地步骤为：首先，除去步骤1)所得样品溶液中的溶剂，复溶后加入石墨化炭黑材料进行除杂，收集除杂后所得上清液，即为植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液。按上述方案，步骤2)中更优选地步骤为：首先，除去步骤1)所得样品溶液中的溶剂，得到样品渣；然后所得样品渣加入溶剂B复溶，得到复溶后的样品溶液；接着，将所得复溶后的样品溶液中加入石墨化炭黑材料进行除杂，收集除杂后所得上清液；最后，将除杂后所得上清液中的溶液B除去，加入溶剂C复溶，得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液。其中，溶剂B为可以溶解样品渣，且不吸附或者少吸附目标分析物多种内源性植物激素的溶剂，例如甲醇及其与水的混合溶液、乙腈及其与水的混合溶液等；所述溶剂C能与后续的分离条件相适应，例如甲醇及其与水的混合溶液、乙腈及其与水的混合溶液等。按上述方案，所述步骤2)中的石墨化炭黑材料为含有π-π共轭基团的炭基颗粒及包含该种炭基颗粒的凝胶、磁性材料、无定型材料、填充柱或整体柱等中的一种或几种。所述的除杂是指除去样品溶液中含有的大量色素、脂质和强疏水性杂质，故采用由碳材料为基底，构建的硅胶颗粒、填充柱或整体柱等均可以达到除杂的目的。本专利技术在上述前处理方法的基础上还提供一种植物样品中多种内源性植物激素的同时定量检测方法，将前处理方法所得植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液通过分析仪器采集响应信号或者数据，进而采用内标法同时定量测定植物样品中的多种内源性植物激素。按上述方案，所述分析仪器可以采用液相色谱-光学检测器、液相色谱-质谱仪联用、毛细管电泳-光学检测器联用、毛细管电泳-质谱仪联用等。优选地，所述分析仪器采用高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法，其特征在于主要步骤如下：1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；2)以石墨化炭黑材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液，从而实现植物样品中多种内源性植物激素的样品前处理。

【技术特征摘要】
1.一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法，其特征在于主要步骤如下：1)在植物样品中定量加入多种内源性植物激素的同位素内标，然后以溶剂提取得到样品溶液；2)以石墨化炭黑材料为净化介质对步骤1)所得样品溶液进行除杂，进而得到植物样品中多种内源性植物激素的待测溶液，从而实现植物样品中多种内源性植物激素的样品前处理。2.根据权利要求1所述的一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述内源性植物激素的种类主要包括生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、茉莉酸类、水杨酸类以及脱落酸类的内源性植物激素。3.根据权利要求2所述的一种植物样品中多种内源性植物激素的前处理方法，其特征在于所述内源性植物激素主要包括吲哚-3-乙酸，吲哚-3-丁酸，脱落酸，水杨酸，反式玉米素，反式玉米素核苷，顺式玉米素，顺式玉米素核苷，异戊烯基腺嘌呤，异戊烯基腺嘌呤核苷，双氢玉米素，双氢玉米素核苷，反式玉米素-7-糖苷，反式玉米素-9-糖苷，顺式玉米素-9-糖苷，顺式玉米素-O-糖苷，双氢玉米素-7-糖苷，双氢玉米素-9-糖苷，双氢玉米素-O-糖苷，异戊烯基腺嘌呤-7-糖苷，异戊烯基腺嘌呤-9-糖苷，2-苄硫基异戊烯基腺嘌呤，2-氯反式玉米素，2-甲硫基反式玉米素，2-甲硫基顺式玉米素，2-甲硫基反式玉米素核苷，2-甲硫基顺式玉米素核苷，2-甲硫基异戊烯基腺嘌呤，2-甲硫基异戊烯基腺嘌呤核苷，赤霉素1，赤霉素3，赤霉素4，赤霉素5，赤霉素6，赤霉素7，赤霉素8，赤霉素9，赤霉素12，赤霉素13，赤霉素15，赤霉素19，赤霉素20，赤霉素23，赤霉素24，赤霉素29，赤霉素34，赤霉素44，赤霉素51，赤霉素53，茉莉酸，茉莉酸-异亮氨酸，茉莉酸-苯丙氨酸，12-羟基茉莉酸，12-氧代植二烯酸，脱落酸和水杨酸。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯钰锜，蔡文静，叶甜甜，蔡保东，
申请(专利权)人：武汉绿剑可瑞信科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42